Методы секвенирования ДНК и РНК

Методы секвенирования определяют точный порядок нуклеотидов в ДНК или, после конверсии, в РНК. От химического метода обрыва цепи по Сэнгеру до массово-параллельных платформ нового поколения эти методы позволяют молекулярной патологии считывать гены по основаниям, обнаруживать мутации и профилировать экспрессию генов в больших масштабах.

Definition

Методы секвенирования ДНК и РНК — это лабораторные методы, которые считывают линейный порядок нуклеотидных оснований в молекуле нуклеиновой кислоты; РНК обычно подвергается обратной транскрипции в комплементарную ДНК перед секвенированием.

Scope

Тема охватывает секвенирование первого поколения (по Сэнгеру), секвенирование нового поколения (массово-параллельное) и секвенирование РНК для анализа транскриптома, а также общий рабочий процесс подготовки библиотек, секвенирования и выравнивания прочтений. Она представлена как методологический справочный материал, а не как руководство по клиническому тестированию.

Key concepts

• Секвенирование с обрывом цепи (по Сэнгеру)
• Секвенирование нового поколения / массово-параллельное секвенирование
• Подготовка библиотеки
• Прочтения секвенирования и покрытие
• Выравнивание прочтений и выявление вариантов
• Секвенирование РНК (транскриптомика)
• Таргетное, экзомное и полногеномное секвенирование

Mechanisms

Секвенирование по Сэнгеру включает введение дидезоксинуклеотидов, обрывающих цепь, для генерации фрагментов различной длины, которые разделяются по размеру для реконструкции последовательности (Sanger et al., 1977). Секвенирование нового поколения вместо этого подготавливает библиотеку фрагментированной ДНК, амплифицирует ее пространственно и секвенирует миллионы фрагментов параллельно, считывая короткие участки, сигналы которых собираются вычислительно (Margulies et al., 2005; Goodwin et al., 2016). Секвенирование РНК применяет тот же параллельный подход к комплементарной ДНК, полученной из РНК, количественно определяя транскрипты и выявляя паттерны сплайсинга и экспрессии (Wang et al., 2009). Прочтения выравниваются по референсной последовательности для идентификации вариантов или измерения обилия.

Clinical relevance

Секвенирование поддерживает обнаружение вариантов, связанных с заболеваниями, и молекулярную характеристику опухолей и патогенов. Эта статья объясняет, как методы генерируют данные последовательности, и предназначена в качестве справочника; она не дает советов по выбору, интерпретации или действиям на основе результатов секвенирования в индивидуальном уходе за пациентами.

Evidence & guidelines

Методы основаны на фундаментальной первичной литературе, начиная с метода обрыва цепи по Сэнгеру 1977 года, через первую высокопроизводительную пиколитровой платформу (Margulies et al., 2005) и последовательность генома человека (Venter et al., 2001), с последующими обзорами, охватывающими десятилетие технологий нового поколения и развитие RNA-Seq (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

History

Метод обрыва цепи по Сэнгеру (1977) сделал секвенирование ДНК рутинным и лег в основу первого секвенирования генома человека (Venter et al., 2001). Введение массово-параллельного секвенирования в середине 2000-х годов значительно снизило стоимость и увеличило пропускную способность (Margulies et al., 2005), и в течение десятилетия секвенирование нового поколения и RNA-Seq стали стандартными инструментами для геномики и транскриптомики (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

Key figures

• Frederick Sanger
• J. Craig Venter
• Marcel Margulies

Seminal works

• sanger-1977
• margulies-2005
• goodwin-2016

Frequently asked questions

Чем секвенирование нового поколения отличается от секвенирования по Сэнгеру?

Секвенирование по Сэнгеру считывает один фрагмент ДНК за раз, используя химический метод обрыва цепи, тогда как секвенирование нового поколения считывает миллионы фрагментов одновременно в массово-параллельном режиме, значительно увеличивая пропускную способность и снижая стоимость за основание.

Можно ли секвенировать РНК напрямую?

РНК обычно сначала преобразуется в комплементарную ДНК путем обратной транскрипции, а затем секвенируется; этот подход RNA-Seq количественно определяет транскрипты и выявляет паттерны сплайсинга и экспрессии.