CRISPR и редактирование генома

Как программируемые нуклеазы, особенно РНК-направляемые системы CRISPR–Cas, делают целенаправленные разрезы в ДНК, что позволяет исследователям редактировать геномы с беспрецедентной легкостью.

Definition

Редактирование генома — это целенаправленное изменение ДНК организма в выбранных участках с использованием программируемых нуклеаз; CRISPR–Cas — это РНК-направляемая система, полученная из бактериального иммунитета, в которой направляющая РНК направляет нуклеазу Cas к соответствующей последовательности ДНК для создания двухцепочечного разрыва для редактирования.

Scope

Эта тема охватывает целенаправленное редактирование генома, сосредоточенное на CRISPR–Cas. В ней рассматривается бактериальное происхождение CRISPR как адаптивной иммунной системы, принцип РНК-направляемого расщепления ДНК с помощью Cas9, как полученный разрыв восстанавливается для удаления или вставки последовательности, а также краткое сравнение с более ранними программируемыми нуклеазами. В ней рассматривается метод и его логика; более широкие методы клонирования, амплификации и секвенирования рассматриваются в сопутствующих темах.

Core questions

• Откуда происходит CRISPR и какова его естественная функция?
• Как направляющая РНК направляет Cas9 к определенной последовательности ДНК?
• Как двухцепочечный разрыв используется для удаления или вставки последовательности?
• Как CRISPR сравнивается с более ранними инструментами редактирования генома?

Key theories

РНК-направляемое расщепление ДНК

Йинек и коллеги показали, что нуклеаза Cas9 может быть запрограммирована одной направляющей РНК для разрезания любой соответствующей последовательности ДНК, превращая бактериальную иммунную систему в универсальный, легко нацеливаемый инструмент редактирования.

Редактирование, направляемое репарацией

Двухцепочечный разрыв, созданный в целевом участке, восстанавливается собственными путями клетки, так что ошибочное соединение концов нарушает ген или гомологично-направленная репарация вносит определенное изменение, предоставленное шаблоном.

Mechanisms

При редактировании CRISPR–Cas направляющая РНК образует пары оснований с целевой последовательностью ДНК, прилегающей к короткому мотиву распознавания, направляя нуклеазу Cas для разрезания обеих цепей в этом месте. Затем клетка восстанавливает разрыв: негомологичное соединение концов часто приводит к небольшим вставкам или делециям, которые инактивируют ген, в то время как гомологично-направленная репарация, при наличии донорского шаблона, вносит точное изменение последовательности. Поскольку специфичность определяется просто последовательностью направляющей РНК, систему гораздо легче перенацеливать, чем более ранние белково-программируемые нуклеазы.

Clinical relevance

Редактирование генома разрабатывается для генной и клеточной терапии и является стандартным исследовательским инструментом, в то время как его использование у людей вызывает значительные этические соображения; представлено как значимость, а не как клиническое руководство.

History

Основываясь на открытии того, что локусы CRISPR образуют бактериальную адаптивную иммунную систему, демонстрация Дудной и Шарпантье в 2012 году того, что Cas9 может быть запрограммирован одной направляющей РНК, установила редактирование генома CRISPR, признанное Нобелевской премией по химии 2020 года.

Debates

Редактирование зародышевой линии человека

Редактирование наследуемых клеток вызывает этические проблемы и проблемы безопасности, связанные с согласием, внецелевыми эффектами и справедливостью; научное сообщество призвало к осторожности, в то время как приложения к ненаследуемым клеткам развиваются.

Key figures

• Jennifer Doudna
• Emmanuelle Charpentier

Seminal works

• jinek2012
• watson2013

Frequently asked questions

Что делает направляющая РНК в CRISPR?

Она образует пары оснований с соответствующей последовательностью ДНК и направляет нуклеазу Cas для разрезания в этом месте, поэтому изменение направляющей РНК изменяет цель.

Как разрезание ДНК приводит к редактированию?

Клетка восстанавливает разрыв; в зависимости от пути и предоставленного шаблона, это либо нарушает ген, либо вносит точное запланированное изменение.