Технологии генотипирования и секвенирования

Технологии генотипирования и секвенирования — это лабораторные методы, которые позволяют выявлять генетические вариации, сообщаемые фармакогеномным тестом. Они варьируются от таргетных анализов, исследующих фиксированный список известных вариантов, до секвенирования нового поколения, которое считывает участки ДНК по основаниям. Выбор платформы определяет, какие варианты могут быть обнаружены, как обрабатываются редкие или структурно сложные аллели, и, следовательно, насколько полно может быть охарактеризован фармакогеномный профиль пациента.

Definition

Технологии генотипирования и секвенирования — это аналитические методы, используемые для выявления наследуемых вариаций ДНК в фармакогенах, включающие таргетные анализы генотипирования, которые проверяют предопределенные варианты, и методы секвенирования, которые считывают базовую последовательность ДНК для идентификации как известных, так и новых вариантов.

Scope

Данная статья охватывает основные классы технологий детекции, используемых в фармакогеномных лабораториях: таргетное генотипирование однонуклеотидных вариантов (массивы и аллель-специфические анализы) и подходы к секвенированию, включая Сэнгер-секвенирование и секвенирование нового поколения. В ней объясняется, почему панели генотипирования обнаруживают только заранее заданные варианты, в то время как секвенирование может выявлять новые и сложные варианты, а также почему сложные фармакогены, такие как CYP2D6, представляют вызов для любой платформы. Это справочное описание методов, а не лабораторный протокол или руководство по назначению тестов.

Core questions

• В чем разница между таргетным генотипированием и секвенированием, и что обнаруживает каждый из них?
• Почему панели генотипирования сообщают только об ограниченном наборе вариантов?
• Как платформы секвенирования обрабатывают новые или редкие варианты фармакогенов?
• Почему гены, такие как CYP2D6, технически сложно точно типировать?

Key concepts

• Таргетное генотипирование против нетаргетного секвенирования
• Массивы однонуклеотидных вариантов
• Секвенирование нового поколения
• Секвенирование по Сэнгеру
• Определение звездчатых аллелей и диплотипов
• Структурные вариации и число копий в фармакогенах
• Аналитическое покрытие и варианты, которые панель пропускает

Mechanisms

Таргетные анализы генотипирования проверяют образец ДНК на наличие заранее определенного набора вариабельных позиций, обычно распространенных, хорошо охарактеризованных однонуклеотидных вариантов и выбранных структурных изменений; они быстры и недороги, но сообщают только о тех вариантах, для обнаружения которых они были разработаны. Секвенирование, напротив, считывает нуклеотидную последовательность целевых регионов, поэтому оно может идентифицировать как установленные, так и ранее не наблюдавшиеся варианты, включая редкие аллели, которые пропускают таргетные панели (Tafazoli et al., 2021; Roden, 2019). Обнаруженные варианты сопоставляются со стандартизированными определениями звездчатых аллелей и объединяются в диплотип; Консорциум по вариациям фармакогенов поддерживает эталонные определения аллелей, которые обеспечивают согласованность этого сопоставления между лабораториями (Gaedigk et al., 2017; Gaedigk et al., 2021). Высокополиморфные и структурно вариабельные гены, такие как CYP2D6, которые могут нести делеции, дупликации и гибридные аллели, остаются технически сложными для каждой платформы.

Clinical relevance

Платформа, используемая лабораторией, определяет, что может утверждать фармакогеномный результат: нормальный результат таргетного генотипирования означает лишь отсутствие протестированных вариантов, а не то, что ген свободен от всех вариаций. Признание этого различия является частью оценки фармакогеномного отчета. Эта статья описывает, как обнаруживаются вариации, и не является руководством по выбору, назначению или интерпретации конкретного теста.

Evidence & guidelines

Эталонные определения аллелей, используемые для интерпретации результатов генотипирования и секвенирования, курируются Консорциумом по вариациям фармакогенов, который стандартизирует номенклатуру звездчатых аллелей для всех фармакогенов (Gaedigk et al., 2017; Gaedigk et al., 2021). Обзоры секвенирования нового поколения в клинической фармакогеномике описывают сравнительное покрытие и ограничения платформ (Tafazoli et al., 2021). Это методологические ссылки, а не предписывающие стандарты лечения.

History

Детекция фармакогенов началась с анализов отдельных генов и секвенирования по Сэнгеру, затем расширилась за счет высокопроизводительных массивов однонуклеотидных вариантов, которые позволяли типировать множество вариантов одновременно. Появление секвенирования нового поколения сделало возможным считывание целых фармакогенов и обнаружение редких и новых аллелей, сместив фокус области от тестирования только распространенных известных вариантов к более полной характеристике (Tafazoli et al., 2021; Roden, 2019). Параллельно консолидация номенклатуры аллелей под эгидой Консорциума по вариациям фармакогенов дала этой области общую систему отсчета для наименования того, что обнаруживают эти технологии (Gaedigk et al., 2017).

Debates

Таргетное генотипирование против секвенирования для клинического тестирования

Таргетные панели дешевле и быстрее, но пропускают редкие и новые варианты, в то время как секвенирование более полное, но дороже и сложнее в интерпретации; соответствующий баланс для рутинного фармакогеномного тестирования все еще обсуждается.

Key figures

• Andrea Gaedigk
• Magnus Ingelman-Sundberg
• Teri E. Klein
• Dan M. Roden

Seminal works

• gaedigk-2017
• tafazoli-2021
• roden-2019

Frequently asked questions

Означает ли нормальный результат генотипирования, что у пациента нет соответствующих вариантов?

Не обязательно. Таргетное генотипирование обнаруживает только те специфические варианты, для тестирования которых оно предназначено, поэтому нормальный результат исключает эти варианты, но не может исключить редкие или новые, которые можно было бы обнаружить только с помощью секвенирования.

Почему CYP2D6 считается сложным для генотипирования?

CYP2D6 является высокополиморфным и подвержен структурным изменениям, таким как делеции генов, дупликации и гибридные аллели, которые технически трудно обнаружить и точно разрешить на многих платформах.