Hibridização In Situ por Fluorescência (FISH)

A hibridização in situ por fluorescência (FISH) é uma técnica citogenética molecular que utiliza sondas de DNA marcadas fluorescentemente para se ligarem a sequências cromossómicas específicas, que são então visualizadas diretamente em cromossomas ou em núcleos celulares sob um microscópio de fluorescência. Ao direcionar loci definidos em vez de escanear o genoma inteiro, a FISH detecta e localiza deleções, duplicações, rearranjos e aneuploidias específicas com alta sensibilidade, inclusive em células não-divididas (interfásicas).

Definition

FISH é uma técnica na qual uma sonda de ácido nucleico marcada é hibridizada a sequências complementares fixadas em uma preparação cromossômica ou núcleo celular e detectada por fluorescência, permitindo que alvos genômicos específicos sejam identificados, contados ou localizados.

Scope

Este tópico aborda o princípio da hibridização de sondas, os principais tipos de sondas e seus usos (sondas locus-específicas, centroméricas e de pintura de cromossomo inteiro), e a aplicação da FISH a células em metáfase e interfase. É uma referência metodológica e não fornece orientação de manejo clínico.

Core questions

• Como uma sonda marcada consegue uma ligação específica e detectável ao seu alvo cromossômico?
• O que distingue as sondas locus-específicas, centroméricas e de pintura cromossômica?
• Por que a FISH pode ser aplicada a células em interfase, bem como em metáfase?
• Quais anormalidades direcionadas a FISH resolve que o bandeamento não consegue?

Key concepts

• Hibridização de ácido nucleico
• Sonda marcada fluorescentemente
• Sonda locus-específica
• Sonda centromérica (alfa-satélite)
• Sonda de pintura de cromossomo inteiro
• FISH em interfase versus metáfase
• Especificidade da sonda e contagem de sinal
• Detecção de microdeleção

Mechanisms

Uma sonda de DNA complementar a uma sequência-alvo é marcada com um fluoróforo (diretamente ou via uma molécula repórter). O DNA cromossômico-alvo em uma lâmina e a sonda são desnaturados para fitas simples e então permitidos a anelar, de modo que a sonda se hibridize à sua sequência complementar no local. Após a remoção da sonda não ligada, o sinal ligado é visualizado por microscopia de fluorescência. Diferentes designs de sondas servem a diferentes propósitos: sondas locus-específicas detectam ou confirmam ganhos, perdas ou rearranjos em um gene ou região definida; sondas centroméricas contam cópias de um determinado cromossomo (enumeração de aneuploidia); e sondas de pintura de cromossomo inteiro marcam um cromossomo inteiro para caracterizar rearranjos complexos. Como a hibridização não requer células em divisão, a FISH pode ser realizada em núcleos interfásicos, estendendo a análise a tecidos e amostras nos quais preparações de metáfase são difíceis de obter.

Clinical relevance

A FISH é utilizada para confirmar ou excluir condições específicas de microdeleção e microduplicação, para enumerar aneuploidias e para detectar rearranjos definidos, como aqueles que caracterizam certos tipos de câncer. Ela complementa o cariótipo ao adicionar detecção direcionada e de alta sensibilidade, inclusive em células interfásicas. Esta entrada descreve como os achados da FISH são gerados; não é uma base para decisões individuais de diagnóstico ou tratamento.

Evidence & guidelines

Os achados da FISH são descritos dentro do Sistema Internacional para Nomenclatura Citogenômica Humana (ISCN), que inclui notação para sinais de sonda e resultados de hibridização.

History

A hibridização in situ foi desenvolvida pela primeira vez com sondas radioativas no final da década de 1960. A mudança para a detecção fluorescente, demonstrada quantitativamente por Pinkel, Straume e Gray em 1986, proporcionou um método mais rápido, seguro e capaz de múltiplas cores e lançou a citogenética molecular. Designs de sondas subsequentes e abordagens multicoloridas estenderam a FISH da detecção de locus único para a análise simultânea de muitos alvos, unindo a citogenética clássica e a genética molecular.

Key figures

• Daniel Pinkel
• Joe W. Gray
• Michael Speicher
• Nigel Carter

Seminal works

• pinkel-1986
• speicher-carter-2005

Frequently asked questions

Como a FISH difere do cariótipo?

O cariótipo escaneia o genoma inteiro em baixa resolução e revela rearranjos balanceados e ploidia, enquanto a FISH usa sondas marcadas para interrogar loci específicos com alta sensibilidade, inclusive em células interfásicas não-divididas. São abordagens complementares.

A FISH pode ser realizada sem células em divisão?

Sim. Como a hibridização não depende da condensação cromossômica, a FISH pode ser aplicada a núcleos interfásicos, permitindo a análise de amostras das quais os cromossomos metafásicos não podem ser facilmente obtidos.