Microscopia Confocal e de Fluorescência

A microscopia de fluorescência gera imagens de espécimes excitando moléculas fluorescentes e coletando a luz de maior comprimento de onda que elas emitem, proporcionando imagens de células de alto contraste e molecularmente específicas. A microscopia confocal adiciona um orifício que rejeita a luz fora de foco, produzindo cortes ópticos nítidos que podem ser montados em visualizações tridimensionais da célula.

Definition

A microscopia de fluorescência utiliza a absorção e reemissão de luz por fluoróforos para gerar imagens de estruturas marcadas; a microscopia confocal é uma técnica de fluorescência na qual um orifício exclui a luz fora de foco, de modo que apenas um plano fino em foco contribui para cada imagem, produzindo cortes ópticos.

Scope

Esta entrada aborda o princípio do contraste por fluorescência, a vantagem do corte óptico da imagem confocal e a ampla classe de métodos de super-resolução que levam a imagem de fluorescência abaixo do limite de difração. Ela trata esses tópicos como métodos de imagem dentro da biologia celular e não como instrução clínica.

Core questions

• Como a fluorescência proporciona contraste molecular em uma célula?
• Como um orifício confocal produz cortes ópticos?
• Como as imagens tridimensionais de células são reconstruídas?
• Como os métodos de super-resolução excedem o limite de difração?

Key concepts

• Excitação e emissão de fluorescência
• Fluoróforos e proteínas fluorescentes
• Orifício confocal e corte óptico
• Reconstrução tridimensional
• Fotobranqueamento e fototoxicidade
• Imagem de super-resolução (ilimitada pela difração)

Mechanisms

Na microscopia de fluorescência, um fluoróforo absorve a luz de excitação e reemite em um comprimento de onda mais longo, que é separado da excitação por filtros para fornecer um contraste brilhante e específico contra um fundo escuro, conforme revisado por Lichtman e Conchello. Uma imagem de fluorescência convencional, no entanto, contém luz de embaçamento de cima e de baixo do plano focal; a microscopia confocal posiciona um orifício conjugado ao ponto focal para que a luz fora de foco seja rejeitada, produzindo os cortes ópticos descritos por Conchello e Lichtman que podem ser empilhados em três dimensões. Como a emissão, como toda microscopia de luz, ainda está sujeita ao limite de difração, abordagens de super-resolução, como a microscopia de depleção por emissão estimulada, introduzida por Hell e Wichmann, manipulam o próprio processo de fluorescência para resolver detalhes muito abaixo desse limite, conforme pesquisado por Schermelleh e colegas.

Clinical relevance

A microscopia confocal e de fluorescência são amplamente utilizadas em patologia, oftalmologia e pesquisa biomédica para localizar moléculas e obter imagens de tecidos em três dimensões. Esta entrada explica os princípios de imagem envolvidos e tem caráter educacional-referencial, não sendo base para decisões individuais de diagnóstico ou tratamento.

History

O princípio confocal foi concebido por Marvin Minsky na década de 1950, mas microscópios confocais de varredura a laser práticos e fluoróforos sintéticos e geneticamente codificados brilhantes tornaram a imagem de fluorescência dominante na biologia celular a partir do final do século XX. A subsequente quebra do limite de difração pela microscopia de depleção por emissão estimulada (Hell & Wichmann, 1994) e técnicas relacionadas abriu a era da imagem de fluorescência de super-resolução resumida por Schermelleh e colegas.

Key figures

• Jeff Lichtman
• Jose-Angel Conchello
• Stefan Hell
• Marvin Minsky

Seminal works

• lichtman-2005
• conchello-2005
• hell-1994
• schermelleh-2010

Frequently asked questions

O que faz o orifício confocal?

Ele é posicionado de forma que a luz de fora do plano focal seja bloqueada, deixando apenas a luz em foco para formar a imagem; isso produz um corte óptico fino que pode ser combinado com outros em uma visualização tridimensional.

Como a microscopia de fluorescência pode superar o limite de difração?

Métodos de super-resolução, como a microscopia de depleção por emissão estimulada, controlam o processo de emissão de fluorescência para que detalhes bem abaixo do limite clássico de difração possam ser resolvidos.