PCRと核酸増幅

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、選択されたDNAセグメントを指数関数的に複製する周期的でプライマー指向性の方法であり、それに基づいて構築されたより広範な増幅技術群である。

Definition

ポリメラーゼ連鎖反応は、DNA鎖の分離、隣接プライマーのアニーリング、耐熱性DNAポリメラーゼによる伸長を繰り返すサイクルによって、定義されたDNA領域を指数関数的に増幅するin vitro法である。より広範な核酸増幅は、DNAまたはRNA配列を複製するための関連技術を包含する。

Scope

このトピックでは、核酸増幅の原理とバリアントについて説明する。具体的には、ポリメラーゼ連鎖反応を特徴づける変性、プライマーアニーリング、伸長といった熱サイクル、プライマーと耐熱性ポリメラーゼの役割、そして逆転写や定量的リアルタイム増幅などの拡張技術である。本稿では、その方法論と論理について扱い、増幅されたDNAを使用するシーケンシングとクローニングについては、関連トピックで取り上げる。

Core questions

• 加熱と冷却の繰り返しサイクルは、どのようにして特定のDNA領域を増幅するのか？
• なぜ2つのプライマーと耐熱性ポリメラーゼが不可欠なのか？
• 増幅はどのようにして指数関数的になるのか？
• 核酸を定量したり、RNAを増幅したりするために、この方法はどのように拡張されるのか？

Key theories

プライマーによって定義される指数関数的増幅

標的を挟む一対のプライマーが増幅領域を定義し、各々の新しい鎖が次のサイクルで鋳型として機能するため、標的コピーの数はサイクルごとにほぼ倍増し、指数関数的に増加する。

耐熱性ポリメラーゼがサイクリングを可能にする

耐熱性DNAポリメラーゼを使用することで、酵素を再添加することなく高温での変性を繰り返すことが可能になり、自動熱サイクリングが実用的になり、反応が堅牢になる。

Mechanisms

各サイクルでは、サンプルを加熱してDNA鎖を分離し、冷却して2つのプライマーが標的の両側の配列にアニーリングするようにし、伸長温度まで加温して耐熱性ポリメラーゼがプライマーから新しい鎖を合成する。1つのサイクルの産物が次のサイクルの鋳型となるため、標的領域は多くのサイクルを経て指数関数的に増幅される。バリアントには、まずRNAをDNAにコピーする逆転写増幅や、産物の蓄積を監視して開始量を測定するリアルタイム定量的増幅などがある。

Clinical relevance

増幅は、遺伝子検査、病原体検出、法医学的同定の中心的な技術である。ここでは臨床的ガイダンスではなく、その重要性として提示する。

History

Mullisは1980年代初頭にポリメラーゼ連鎖反応を考案し、1985年のSaikiらの報告によってその利用が実証された。その後、耐熱性ポリメラーゼの採用により日常的な技術となり、この発明は1993年のノーベル化学賞によって認められた。

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki1985
• lodish2016

Frequently asked questions

PCRになぜプライマーが必要なのですか？

プライマーは各鎖の合成開始点を定義するため、どの領域が複製されるかを決定し、ポリメラーゼが伸長を開始できるようにします。

何が増幅を指数関数的にするのですか？

各サイクルの新しい鎖が次のサイクルの鋳型となるため、標的のコピー数はサイクルごとにほぼ倍増します。