ایمونوهیستوشیمی و روش‌های تشخیص پروتئین

ایمونوهیستوشیمی (IHC) پروتئین‌ها را در برش‌های بافتی با استفاده از آنتی‌بادی‌های متصل به یک نشانگر قابل مشاهده، مکان‌یابی و اندازه‌گیری می‌کند و نشان می‌دهد که یک محصول ژنی در کجا بیان می‌شود و به صورت نیمه‌کمی، چه مقدار. به عنوان همتای سطح پروتئین برای کمی‌سازی رونوشت، این یک ابزار معمول در آسیب‌شناسی تشخیصی و مولکولی است.

Definition

ایمونوهیستوشیمی یک روش مبتنی بر بافت است که از آنتی‌بادی‌های نشان‌دار برای تشخیص پروتئین‌های خاص درجا (in situ) استفاده می‌کند، مکان سلولی و زیرسلولی آن‌ها را تجسم می‌بخشد و تخمین نیمه‌کمی از بیان پروتئین را ارائه می‌دهد.

Scope

این موضوع شامل اصل تشخیص مبتنی بر آنتی‌بادی، تفاوت بین مکان‌یابی کیفی و امتیازدهی نیمه‌کمی شدت و وسعت رنگ‌آمیزی، اهمیت استانداردسازی و کنترل‌ها، و کاربردهای شناخته شده‌ای مانند ارزیابی گیرنده هورمونی و HER2 به عنوان نمونه‌هایی از روش است. این روش IHC را به عنوان یک روش اندازه‌گیری در نظر می‌گیرد و آستانه‌های تشخیصی یا جهت‌گیری درمانی را ارائه نمی‌دهد.

Core questions

• چگونه آنتی‌بادی‌های نشان‌دار یک پروتئین را در یک برش بافتی مکان‌یابی می‌کنند؟
• چگونه رنگ‌آمیزی به یک امتیاز نیمه‌کمی تبدیل می‌شود؟
• چرا کنترل‌ها و استانداردسازی برای IHC قابل تکرار ضروری هستند؟
• چگونه تشخیص در سطح پروتئین، کمی‌سازی رونوشت را تکمیل می‌کند؟

Key concepts

• اتصال آنتی‌بادی-آنتی‌ژن
• بازیابی آنتی‌ژن
• تشخیص کروموژنیک و فلورسنت
• امتیازدهی نیمه‌کمی (شدت و وسعت)
• کنترل‌های مثبت و منفی
• اثرات تثبیت پیش‌تحلیلی

Mechanisms

یک آنتی‌بادی اولیه به آنتی‌ژن هدف خود در یک برش بافتی ثابت متصل می‌شود؛ تشخیص از طریق آنتی‌بادی‌های ثانویه و سیستم‌های مرتبط با آنزیم یا فلوروفور که یک رسوب رنگی یا فلورسنت در محل آنتی‌ژن تولید می‌کنند، تقویت می‌شود. مراحل تثبیت و بازیابی آنتی‌ژن بر قابل تشخیص ماندن اپیتوپ‌ها تأثیر می‌گذارند، بنابراین دستکاری پیش‌تحلیلی به شدت بر نتیجه تأثیر می‌گذارد. بیان به صورت نیمه‌کمی با قضاوت شدت رنگ‌آمیزی و نسبت سلول‌های مثبت، که اغلب در یک امتیاز ترکیب می‌شوند، خوانده می‌شود؛ از آنجایی که این خوانش وابسته به ناظر و پروتکل است، کنترل‌های معتبر و روش‌های استاندارد شده برای تکرارپذیری مورد نیاز است. دستورالعمل‌های حرفه‌ای نشان می‌دهند که چگونه امتیازدهی و متغیرهای پیش‌تحلیلی برای آزمایش گیرنده استاندارد می‌شوند (Hammond et al., 2010; Wolff et al., 2013).

Clinical relevance

IHC برای تشخیص بافت و گزارش بیومارکرهای پروتئینی محوری است، و درک ماهیت نیمه‌کمی آن بخشی از تفسیر گزارش‌های آسیب‌شناسی است. این مدخل روش و استانداردسازی آن را توصیف می‌کند؛ دستورالعمل‌های ذکر شده برای نشان دادن روش‌شناسی و گزارش‌دهی ارجاع داده شده‌اند، نه برای ارائه نقاط برش تشخیصی یا تصمیمات درمانی برای بیماران منفرد.

Evidence & guidelines

استانداردسازی IHC نیمه‌کمی با دستورالعمل‌های مشترک ASCO/CAP برای آزمایش گیرنده استروژن و پروژسترون (Hammond et al., 2010) و برای آزمایش HER2 در سرطان پستان (Wolff et al., 2013) نشان داده شده است، که الزامات دستکاری پیش‌تحلیلی، امتیازدهی و کنترل را تعریف می‌کنند. این موارد در اینجا به عنوان مراجع روش‌شناختی ذکر شده‌اند.

History

رنگ‌آمیزی بافت مبتنی بر آنتی‌بادی از ایمونوفلورسانس در اواسط قرن بیستم توسعه یافت، و سپس روش‌های ایمونوپراکسیداز مرتبط با آنزیم که امکان رنگ‌آمیزی دائمی و قابل مشاهده با میکروسکوپ نوری را فراهم می‌کردند. با تبدیل شدن بیومارکرهای پروتئینی به بخش مرکزی آسیب‌شناسی، توجه به استانداردسازی تثبیت، بازیابی آنتی‌ژن و امتیازدهی معطوف شد، که در دستورالعمل‌های اجماعی برای آزمایش گیرنده رسمی شد (Hammond et al., 2010; Wolff et al., 2013).

Debates

امتیازدهی IHC نیمه‌کمی چقدر قابل تکرار است؟

از آنجایی که شدت و وسعت رنگ‌آمیزی به صورت بصری قضاوت می‌شود و به تثبیت و پروتکل بستگی دارد، نتایج می‌تواند بین ناظران و آزمایشگاه‌ها متفاوت باشد؛ پیش‌تحلیل‌های استاندارد شده، کنترل‌های معتبر و معیارهای امتیازدهی تعریف شده برای بهبود تکرارپذیری استفاده می‌شوند.

Key figures

• M. Elizabeth Hammond
• Antonio Wolff
• D. Craig Allred

Seminal works

• hammond-2010
• wolff-2013

Frequently asked questions

آیا ایمونوهیستوشیمی کمی است؟

IHC بهتر است به عنوان نیمه‌کمی توصیف شود: این روش بیان پروتئین را با قضاوت شدت رنگ‌آمیزی و نسبت سلول‌های مثبت تخمین می‌زند، نه با تولید یک غلظت دقیق، به همین دلیل امتیازدهی و کنترل‌های استاندارد شده مهم هستند.

چرا تثبیت بافت بر نتایج IHC تأثیر می‌گذارد؟

تثبیت و مرحله بعدی بازیابی آنتی‌ژن می‌تواند اپیتوپ‌هایی را که آنتی‌بادی‌ها به آن‌ها متصل می‌شوند، پنهان یا آشکار کند، بنابراین تغییر در دستکاری پیش‌تحلیلی می‌تواند رنگ‌آمیزی را تغییر دهد و برای نتایج قابل اعتماد باید استاندارد شود.