پروفایلینگ بیان مبتنی بر میکرواری

میکرواری DNA با هیبریداسیون اسیدهای نوکلئیک نشاندار شده از یک نمونه به یک شبکه متراکم و منظم از پروب‌های مکمل که روی یک سطح جامد ثابت شده‌اند، بیان ژن را اندازه‌گیری می‌کند؛ فلورسانس در هر پروب نشان‌دهنده میزان حضور رونویس مربوطه است. میکرواری‌ها پروفایلینگ بیان در مقیاس ژنوم را در اواخر دهه 1990 و 2000 به یک روش معمول تبدیل کردند و همچنان یک پلتفرم مشخص و مقرون‌به‌صرفه هستند، جایی که مجموعه رونویس‌های قابل اندازه‌گیری از قبل مشخص است.

Definition

پروفایلینگ بیان مبتنی بر میکرواری، فراوانی رونویس را با اندازه‌گیری سیگنال هیبریداسیون اسیدهای نوکلئیک نمونه نشاندار شده به آرایه‌ای ثابت از پروب‌های DNA یا الیگونوکلئوتیدی مکمل، کمی‌سازی می‌کند و یک مقدار بیان نسبی برای هر ژن مورد بررسی ارائه می‌دهد.

Scope

این موضوع به طراحی و استفاده از میکرواری‌های بیان می‌پردازد: چیدمان پروب، نشاندار کردن و هیبریداسیون نمونه، کسب سیگنال مبتنی بر تصویر، و نرمال‌سازی و خلاصه‌سازی مورد نیاز برای تبدیل شدت‌های خام پروب به مقادیر بیان قابل مقایسه. این یک مرجع روش‌شناختی در حوزه ترانسکریپتومیکس است و هیچ راهنمایی بالینی ارائه نمی‌دهد.

Core questions

• پروب‌ها چگونه برای نمایش ژن‌های مورد علاقه طراحی و آرایه می‌شوند؟
• سیگنال هیبریداسیون چگونه با فراوانی رونویس مرتبط است؟
• شدت‌های خام پروب چگونه نرمال‌سازی و به مقادیر بیان برای هر ژن خلاصه‌سازی می‌شوند؟
• چه زمانی یک آرایه با پروب ثابت بر توالی‌یابی مستقیم رونویس‌ها ارجحیت دارد؟

Key concepts

• طراحی پروب و آرایه
• هیبریداسیون و نشاندار کردن فلورسنت
• آرایه‌های دو رنگ در مقابل تک کاناله
• تصحیح پس‌زمینه و نرمال‌سازی
• خلاصه‌سازی در سطح پروب (به عنوان مثال، RMA)
• هیبریداسیون متقاطع و اشباع
• مجموعه پروب ثابت (اندازه‌گیری بسته)

Mechanisms

DNA یا RNA مکمل نشاندار شده که از یک نمونه آماده شده است، روی آرایه‌ای اعمال می‌شود که هزاران پروب با توالی شناخته شده در موقعیت‌های قابل آدرس‌دهی روی آن ثابت شده‌اند. مولکول‌های مکمل به پروب‌های خود هیبرید می‌شوند و یک اسکنر شدت فلورسانس را در هر نقطه ثبت می‌کند که به عنوان یک معیار نسبی از فراوانی رونویس مطابق در نظر گرفته می‌شود. از آنجا که شدت تحت تأثیر پس‌زمینه، میل ترکیبی پروب و تغییرات آرایه به آرایه قرار می‌گیرد، سیگنال‌های خام باید تصحیح پس‌زمینه شوند، در بین آرایه‌ها نرمال‌سازی شوند و از چندین پروب برای هر ژن در یک تخمین بیان واحد خلاصه‌سازی شوند؛ روش میانگین چند آرایه‌ای قوی (RMA) ایریزاری و همکاران یک چارچوب خلاصه‌سازی پرکاربرد است. شنا و همکاران میکرواری cDNA را معرفی کردند و لاکهارت و همکاران آرایه‌های الیگونوکلئوتیدی با چگالی بالا را به عنوان یک پلتفرم کمی برای نظارت بر بیان تثبیت کردند.

Clinical relevance

میکرواری‌ها طبقه‌بندی‌های مولکولی تأثیرگذاری از بیماری‌ها را تولید کردند و پلتفرم اصلی چندین امضای بیان ژنی اولیه بودند که در تحقیقات و محیط‌های ترجمه‌ای استفاده می‌شدند. به عنوان یک موضوع مرجع، این مدخل توضیح می‌دهد که چگونه شواهد بیان مبتنی بر آرایه تولید و نرمال‌سازی می‌شوند؛ این مبنایی برای تصمیم‌گیری‌های تشخیصی یا درمانی فردی نیست.

Evidence & guidelines

مبانی روش‌شناختی، مقالات پلتفرمی شنا و همکاران (آرایه‌های cDNA) و لاکهارت و همکاران (آرایه‌های الیگونوکلئوتیدی) به همراه روش‌های نرمال‌سازی و خلاصه‌سازی مانند RMA (ایریزاری و همکاران) هستند. این‌ها مراجع روش‌شناختی هستند تا دستورالعمل‌های بالینی.

History

میکرواری‌های بیان در اواسط دهه 1990 معرفی شدند، با شنا و همکاران که یک میکرواری cDNA را در سال 1995 نشان دادند و لاکهارت و همکاران که آرایه‌های الیگونوکلئوتیدی با چگالی بالا را در سال 1996 توصیف کردند. در طول دهه بعد، آرایه‌ها به ابزار غالب برای مطالعات بیان در مقیاس ژنوم تبدیل شدند و روش‌های آماری برای نرمال‌سازی و خلاصه‌سازی پروب‌ها به بلوغ رسیدند. از اواخر دهه 2000، توالی‌یابی RNA به تدریج جایگزین آرایه‌ها برای کارهای اکتشافی شد، اگرچه آرایه‌ها در مواردی که مجموعه پروب مشخص و هزینه کمتر مزیت داشت، پابرجا ماندند.

Debates

میکرواری‌ها در مقابل توالی‌یابی RNA

آرایه‌ها فقط رونویس‌هایی را اندازه‌گیری می‌کنند که توسط پروب‌های ثابت آن‌ها نمایش داده می‌شوند و دامنه دینامیکی محدودتری دارند، در حالی که توالی‌یابی رونویس‌ها را مستقیماً اندازه‌گیری می‌کند و می‌تواند رونویس‌های جدید را کشف کند؛ مبادله بین یک سنجش بسته، مشخص و ارزان‌تر و یک پلتفرم اکتشافی باز همچنان بر انتخاب پلتفرم تأثیر می‌گذارد.

Key figures

• Patrick O. Brown
• Mark Schena
• David J. Lockhart
• Rafael Irizarry

Seminal works

• schena-1995
• lockhart-1996
• irizarry-2003

Frequently asked questions

چرا یک میکرواری فقط می‌تواند رونویس‌هایی را اندازه‌گیری کند که برای آن‌ها طراحی شده است؟

سیگنال از هیبریداسیون به پروب‌هایی با توالی شناخته شده که روی آرایه ثابت شده‌اند، ناشی می‌شود، بنابراین هر رونویسی بدون پروب مطابق قابل تشخیص نیست. این امر میکرواری‌ها را به یک سنجش بسته تبدیل می‌کند، برخلاف توالی‌یابی که مستقیماً رونویس‌ها را نمونه‌برداری می‌کند.

نرمال‌سازی در داده‌های میکرواری چه چیزی را تصحیح می‌کند؟

این روش تغییرات فنی مانند تفاوت‌های پس‌زمینه، کارایی نشاندار کردن و تفاوت‌های شدت آرایه به آرایه را تنظیم می‌کند، به طوری که مقادیر بیان حاصل، تفاوت‌های بیولوژیکی را منعکس کنند نه مصنوعات تجربی را.