Perfiles de Expresión Basados en Microarrays

Un microarray de ADN mide la expresión génica mediante la hibridación de ácidos nucleicos marcados de una muestra a una rejilla densa y ordenada de sondas complementarias fijadas en una superficie sólida; la fluorescencia en cada sonda refleja la cantidad del transcripto correspondiente presente. Los microarrays hicieron que la elaboración de perfiles de expresión a escala genómica fuera rutinaria a finales de los años 90 y en la década de 2000, y siguen siendo una plataforma definida y rentable cuando el conjunto de transcriptos a medir se conoce de antemano.

Definition

La elaboración de perfiles de expresión basados en microarrays cuantifica la abundancia de transcriptos midiendo la señal de hibridación de ácidos nucleicos de muestra marcados a un conjunto fijo de sondas de ADN complementario u oligonucleótidos, produciendo un valor de expresión relativo para cada gen analizado.

Scope

Este tema abarca el diseño y uso de los microarrays de expresión: la disposición de las sondas, el marcaje y la hibridación de las muestras, la adquisición de señales basada en imágenes, y la normalización y el resumen necesarios para convertir las intensidades de sonda crudas en valores de expresión comparables. Es una referencia metodológica dentro de la transcriptómica y no ofrece orientación clínica.

Core questions

• ¿Cómo se diseñan y disponen las sondas para representar los genes de interés?
• ¿Cómo se relaciona la señal de hibridación con la abundancia de transcriptos?
• ¿Cómo se normalizan y resumen las intensidades de sonda crudas en valores de expresión por gen?
• ¿Cuándo es preferible un microarray de sondas fijas a la secuenciación directa de transcriptos?

Key concepts

• Diseño de sondas y microarrays
• Hibridación y marcaje fluorescente
• Microarrays de dos colores versus monocanal
• Corrección de fondo y normalización
• Resumen a nivel de sonda (p. ej., RMA)
• Hibridación cruzada y saturación
• Conjunto de sondas fijo (medición cerrada)

Mechanisms

El ADN o ARN complementario marcado, preparado a partir de una muestra, se aplica a un microarray en el que miles de sondas de secuencia conocida están fijadas en posiciones direccionables. Las moléculas complementarias se hibridan con sus sondas, y un escáner registra la intensidad de fluorescencia en cada punto, lo que se toma como una medida relativa de la abundancia del transcripto correspondiente. Dado que la intensidad se ve afectada por el fondo, la afinidad de la sonda y la variación entre microarrays, las señales crudas deben corregirse del fondo, normalizarse entre microarrays y resumirse a partir de múltiples sondas por gen en una única estimación de expresión; el método Robust Multi-array Average (RMA) de Irizarry y sus colegas es un marco de resumen ampliamente utilizado. Schena y sus colegas introdujeron el microarray de ADNc, y Lockhart y sus colegas establecieron los microarrays de oligonucleótidos de alta densidad como una plataforma cuantitativa de monitorización de la expresión.

Clinical relevance

Los microarrays produjeron clasificaciones moleculares influyentes de enfermedades y fueron la plataforma detrás de varias firmas de expresión génica tempranas utilizadas en entornos de investigación y traslacionales. Como tema de referencia, esta entrada explica cómo se genera y normaliza la evidencia de expresión basada en microarrays; no es una base para decisiones diagnósticas o de tratamiento individuales.

Evidence & guidelines

Los fundamentos metodológicos son los artículos de plataforma de Schena y sus colegas (microarrays de ADNc) y Lockhart y sus colegas (microarrays de oligonucleótidos), junto con métodos de normalización y resumen como RMA (Irizarry y sus colegas). Estas son referencias metodológicas en lugar de guías clínicas.

History

Los microarrays de expresión se introdujeron a mediados de la década de 1990, con Schena y sus colegas demostrando un microarray de ADNc en 1995 y Lockhart y sus colegas describiendo microarrays de oligonucleótidos de alta densidad en 1996. Durante la década siguiente, los microarrays se convirtieron en la herramienta dominante para los estudios de expresión a escala genómica, y los métodos estadísticos para la normalización y el resumen de sondas maduraron. Desde finales de la década de 2000, la secuenciación de ARN desplazó progresivamente a los microarrays para el trabajo de descubrimiento, aunque los microarrays persistieron donde un conjunto de sondas definido y un menor costo eran ventajosos.

Debates

Microarrays versus secuenciación de ARN

Los microarrays miden solo los transcriptos representados por sus sondas fijas y tienen un rango dinámico más estrecho, mientras que la secuenciación mide los transcriptos directamente y puede descubrir otros nuevos; la compensación entre un ensayo cerrado definido y más económico y una plataforma de descubrimiento abierta sigue influyendo en la elección de la plataforma.

Key figures

• Patrick O. Brown
• Mark Schena
• David J. Lockhart
• Rafael Irizarry

Seminal works

• schena-1995
• lockhart-1996
• irizarry-2003

Frequently asked questions

¿Por qué un microarray solo puede medir los transcriptos para los que fue diseñado?

La señal surge de la hibridación con sondas de secuencia conocida fijadas en el microarray, por lo que cualquier transcripto sin una sonda coincidente no puede ser detectado. Esto convierte a los microarrays en un ensayo cerrado, a diferencia de la secuenciación, que muestrea los transcriptos directamente.

¿Qué corrige la normalización en los datos de microarrays?

Ajusta la variación técnica, como las diferencias en el fondo, la eficiencia del marcaje y las diferencias de intensidad entre microarrays, para que los valores de expresión resultantes reflejen diferencias biológicas en lugar de artefactos experimentales.