Métodos de secuenciación de ADN y ARN

Los métodos de secuenciación determinan el orden preciso de los nucleótidos en el ADN o, tras su conversión, en el ARN. Desde la química de terminación de cadena de Sanger hasta las plataformas de secuenciación de próxima generación masivamente paralelas, estas técnicas permiten a la patología molecular leer genes base por base, detectar mutaciones y perfilar la expresión génica a gran escala.

Definition

Los métodos de secuenciación de ADN y ARN son técnicas de laboratorio que leen el orden lineal de las bases nucleotídicas en una molécula de ácido nucleico; el ARN se transcribe inversamente a ADN complementario (ADNc) antes de la secuenciación.

Scope

El tema abarca la secuenciación de primera generación (Sanger), la secuenciación de próxima generación (masivamente paralela) y la secuenciación de ARN para el análisis del transcriptoma, junto con el flujo de trabajo general de preparación de librerías, secuenciación y alineación de lecturas. Se presenta como material de referencia metodológico en lugar de como guía para pruebas clínicas.

Key concepts

• Secuenciación por terminación de cadena (Sanger)
• Secuenciación de próxima generación / masivamente paralela
• Preparación de librerías
• Lecturas de secuenciación y cobertura
• Alineación de lecturas e identificación de variantes
• Secuenciación de ARN (transcriptómica)
• Secuenciación dirigida, de exoma y de genoma completo

Mechanisms

La secuenciación de Sanger incorpora dideoxinucleótidos terminadores de cadena para generar fragmentos de todas las longitudes, los cuales se separan por tamaño para reconstruir la secuencia (Sanger et al., 1977). En cambio, la secuenciación de próxima generación prepara una librería de ADN fragmentado, lo amplifica espacialmente y secuencia millones de fragmentos en paralelo, leyendo tramos cortos cuyas señales se ensamblan computacionalmente (Margulies et al., 2005; Goodwin et al., 2016). La secuenciación de ARN aplica el mismo enfoque paralelo al ADN complementario (ADNc) derivado del ARN, cuantificando los transcritos y revelando patrones de empalme y expresión (Wang et al., 2009). Las lecturas se alinean con una referencia para identificar variantes o medir la abundancia.

Clinical relevance

La secuenciación apoya la detección de variantes asociadas a enfermedades y la caracterización molecular de tumores y patógenos. Esta entrada explica cómo los métodos generan datos de secuencia y está destinada a ser una referencia; no asesora sobre la selección, interpretación o actuación en pruebas de secuenciación en la atención individual del paciente.

Evidence & guidelines

Los métodos se basan en una literatura primaria fundamental, desde el método de terminación de cadena de Sanger de 1977 hasta la primera plataforma de picolitros de alto rendimiento (Margulies et al., 2005) y la secuencia del genoma humano (Venter et al., 2001), con revisiones posteriores que examinan una década de tecnologías de próxima generación y el auge de la secuenciación de ARN (RNA-Seq) (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

History

El método de terminación de cadena de Sanger (1977) hizo que la secuenciación de ADN fuera rutinaria y sustentó la primera secuenciación del genoma humano (Venter et al., 2001). La introducción a mediados de la década de 2000 de la secuenciación masivamente paralela redujo drásticamente los costos y aumentó el rendimiento (Margulies et al., 2005), y en una década la secuenciación de próxima generación y la secuenciación de ARN (RNA-Seq) se habían convertido en herramientas estándar para la genómica y la transcriptómica (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).

Key figures

• Frederick Sanger
• J. Craig Venter
• Marcel Margulies

Seminal works

• sanger-1977
• margulies-2005
• goodwin-2016

Frequently asked questions

¿En qué se diferencia la secuenciación de próxima generación de la secuenciación de Sanger?

La secuenciación de Sanger lee un fragmento de ADN a la vez utilizando química de terminación de cadena, mientras que la secuenciación de próxima generación lee millones de fragmentos simultáneamente de forma masivamente paralela, aumentando enormemente el rendimiento y reduciendo el costo por base.

¿Se puede secuenciar el ARN directamente?

El ARN se convierte generalmente primero en ADN complementario (ADNc) mediante transcripción inversa y luego se secuencia; este enfoque de secuenciación de ARN (RNA-Seq) cuantifica los transcritos y revela patrones de empalme y expresión.