Métodos y tecnologías de secuenciación de ARN

La secuenciación de ARN (RNA-seq) mide el transcriptoma convirtiendo el ARN en una biblioteca de secuenciación y contando las lecturas resultantes que se mapean de nuevo a genes y transcritos. Al muestrear los transcritos directamente en lugar de hibridarlos a sondas predefinidas, la RNA-seq puede cuantificar la expresión en un amplio rango dinámico, descubrir transcritos y uniones de empalme previamente no anotados, y resolver la estructura de las isoformas.

Definition

La secuenciación de ARN es un enfoque de secuenciación de alto rendimiento en el que el ARN se transcribe inversamente (o se secuencia directamente) y las lecturas resultantes se mapean y cuentan para cuantificar la abundancia de transcritos y caracterizar la estructura de los transcritos en todo el transcriptoma.

Scope

Este tema cubre el flujo de trabajo experimental y computacional de la RNA-seq: selección de ARN y preparación de la biblioteca, químicas de secuenciación de lectura corta y lectura larga, alineación o pseudoalineación de lecturas, y cuantificación y normalización de la expresión. Es una referencia metodológica dentro de la transcriptómica y no proporciona orientación clínica.

Core questions

• ¿Cómo se convierte una muestra de ARN en una biblioteca de secuenciación y qué pasos de selección (poli-A o agotamiento ribosómico) determinan lo que se mide?
• ¿Cómo se alinean o pseudoalinean las lecturas a una referencia, y se cuantifican por gen o transcrito?
• ¿Cómo se realiza la normalización para que la expresión pueda compararse entre muestras?
• ¿Qué añaden las tecnologías de lectura larga y ARN directo sobre la secuenciación de lectura corta?

Key concepts

• Preparación de la biblioteca y selección de poli-A o agotamiento de ARNr
• Secuenciación de lectura corta versus lectura larga
• Alineación y pseudoalineación de lecturas
• Conteo y cuantificación de lecturas
• Normalización (por ejemplo, unidades como FPKM/TPM)
• Profundidad y cobertura de secuenciación
• Detección de uniones de empalme
• Secuenciación directa de ARN

Mechanisms

En un flujo de trabajo típico, se extrae el ARN y se selecciona un subconjunto (comúnmente ARN mensajero poliadenilado, o ARN total después del agotamiento del ARN ribosómico), se fragmenta, se transcribe inversamente en ADN complementario y se construye en una biblioteca ligada a adaptadores. La biblioteca se secuencia para producir millones de lecturas, que se alinean con un genoma o transcriptoma de referencia, o se cuantifican mediante pseudoalineación sin alineación. Se cuentan las lecturas que se superponen a cada característica; debido a que los transcritos más largos y las muestras secuenciadas más profundamente acumulan más lecturas, los recuentos se normalizan para la longitud del transcrito y el tamaño de la biblioteca antes de comparar la abundancia. Mortazavi y sus colegas introdujeron el marco central de recuento y normalización, y las revisiones de Wang y Ozsolak establecieron las fortalezas y limitaciones de la plataforma. Las tecnologías de lectura larga y ARN directo secuencian moléculas de longitud completa, mejorando la resolución de isoformas a costa de un mayor error por lectura y un menor rendimiento.

Clinical relevance

La RNA-seq genera gran parte de la evidencia de clasificación molecular y descubrimiento de biomarcadores en la investigación y la genómica traslacional, y cada vez más apoya la detección diagnóstica de transcritos y fusiones. Como tema de referencia, explica cómo se produce la evidencia transcriptómica; no es una base para decisiones diagnósticas o de tratamiento individuales.

Evidence & guidelines

Los marcos de mejores prácticas para la RNA-seq se derivan del trabajo de cuantificación fundamental de Mortazavi y sus colegas y de revisiones de métodos (Wang y sus colegas; Ozsolak y Milos). El análisis de lectura larga añade sus propias consideraciones, revisadas por Amarasinghe y sus colegas. Estas son referencias metodológicas en lugar de guías de práctica clínica.

History

La RNA-seq surgió en 2008 cuando la secuenciación de lectura corta de alto rendimiento se aplicó al ARN transcrito inversamente, con Mortazavi y sus colegas estableciendo cómo mapear y cuantificar transcriptomas de mamíferos a partir de recuentos de lecturas. Las revisiones de los años siguientes consolidaron los estándares de preparación y análisis de bibliotecas, y desde mediados de la década de 2010 las plataformas de lectura larga y ARN directo extendieron el enfoque hacia la secuenciación de isoformas de longitud completa.

Debates

Secuenciación de lectura corta versus lectura larga

Las lecturas cortas ofrecen un alto rendimiento y un bajo error por base, pero reconstruyen las isoformas solo indirectamente, mientras que las lecturas largas secuencian transcritos de longitud completa y resuelven las isoformas directamente a costa de mayores tasas de error y menor profundidad; la elección apropiada depende de si la prioridad es la cuantificación precisa o la estructura de la isoforma.

Key figures

• Barbara Wold
• Ali Mortazavi
• Michael Snyder

Seminal works

• mortazavi-2008
• wang-2009
• ozsolak-2011

Frequently asked questions

¿Cuál es la diferencia entre la selección de poli-A y el agotamiento del ARN ribosómico?

La selección de poli-A captura el ARN mensajero poliadenilado y es eficiente para los transcritos codificadores de proteínas, mientras que el agotamiento del ARN ribosómico elimina el ARNr abundante mientras retiene los transcritos no poliadenilados y degradados. La elección determina qué especies de ARN puede medir el experimento.

¿Por qué se normalizan los recuentos de RNA-seq antes de la comparación?

Los recuentos de lecturas crudas dependen de la longitud del transcrito y de la profundidad con la que se secuenció cada muestra, por lo que no se pueden comparar directamente. La normalización ajusta estos factores para que las diferencias en la abundancia reflejen la biología en lugar de la profundidad o longitud técnica.