تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي

يقيس تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي، والذي يُطلق عليه أيضًا تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، تراكم الحمض النووي المضخم دورة بعد دورة من خلال إشارة فلورية، مما يسمح بتقدير الكمية الأولية لتسلسل مستهدف. وبالاقتران مع النسخ العكسي (RT-qPCR)، يعد هذا أحد أكثر الطرق استخدامًا لتحديد التعبير الجيني في علم الأمراض الجزيئي.

Definition

تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي هو طريقة لتضخيم الحمض النووي ترصد تكوين المنتج في الوقت الفعلي عبر الفلورة، باستخدام دورة التحديد الكمي لتقدير الكمية الأولية للحمض النووي (DNA) أو (بعد النسخ العكسي) الحمض النووي الريبوزي (RNA) المستهدف.

Scope

يغطي هذا الموضوع مبدأ قياس تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي، ودورة التحديد الكمي (Cq) وعلاقتها بكمية القالب، والتحديد الكمي النسبي بطريقة 2-DDCT المقارنة، ودور الجينات المرجعية وكفاءة التضخيم، ومعايير الإبلاغ التي تحكم قابلية التكرار. كما يشير إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي كنهج ذي صلة للتحديد الكمي المطلق. ويتناول هذه الأساليب كطرق مخبرية، وليس كبروتوكولات اختبار سريرية.

Core questions

• كيف ترتبط دورة التحديد الكمي بكمية القالب الأولية؟
• كيف يتم حساب التعبير النسبي وتطبيعه في RT-qPCR؟
• لماذا تؤثر كفاءة التضخيم واختيار الجين المرجعي على النتيجة؟
• كيف يختلف تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي في تحقيق التحديد الكمي؟

Key concepts

• دورة التحديد الكمي (Cq / Ct)
• كفاءة التضخيم
• طريقة 2-DDCT المقارنة
• الجينات المرجعية (المنزلية)
• تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي
• تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي والتقسيم
• معايير الإبلاغ MIQE

Mechanisms

خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل، يتضاعف التسلسل المستهدف في كل دورة في المرحلة الأسية، ويصدر كاشف فلوري (صبغة متداخلة أو مسبار خاص بالتسلسل) إشارة تتناسب مع المنتج المتراكم. ترتبط الدورة التي تتجاوز فيها الفلورة عتبة محددة (دورة التحديد الكمي، Cq أو Ct) عكسياً بلوغاريتم الكمية الأولية للقالب، لذا فإن انخفاض Cq يعني وجود المزيد من المستهدف. يتم حساب التعبير النسبي عادةً باستخدام طريقة 2-DDCT المقارنة، التي تقوم بتطبيع Cq للمستهدف إلى جين مرجعي وعينة معايرة، بافتراض كفاءات تضخيم متساوية تقريبًا (Livak & Schmittgen, 2001). نظرًا لأن الكفاءة واستقرار الجين المرجعي وتقلب النسخ العكسي تؤثر جميعها على التقدير، تحدد إرشادات MIQE التفاصيل التجريبية والتحقق اللازم لتكون النتيجة قابلة للتفسير (Bustin et al., 2009). بدلاً من ذلك، يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بتقسيم العينة إلى العديد من التفاعلات ويحسب الأجزاء الإيجابية، مما يوفر تحديدًا كميًا مطلقًا بدون منحنى قياسي (Huggett et al., 2013).

Clinical relevance

يعد RT-qPCR منصة روتينية لقياس مستويات النسخ الكامنة وراء النتائج التشخيصية والتنبؤية الجزيئية، ويعد فهم افتراضاته جزءًا من تفسير التقارير المخبرية. يشرح هذا المدخل الطريقة وقيودها وليس أساسًا لقطع التشخيص أو إدارة المريض، والتي تعتمد على فحوصات معتمدة.

Evidence & guidelines

تحدد إرشادات MIQE (Bustin et al., 2009) توقعات الإبلاغ والجودة لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي، وبالنسبة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي، إرشادات MIQE الرقمية (Huggett et al., 2013). تظل طريقة 2-DDCT المقارنة (Livak & Schmittgen, 2001) المرجع القياسي للتحديد الكمي النسبي.

History

ظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي في التسعينيات عندما تم ربط الكشف الفلوري بالدورة الحرارية، ليحل محل التحديد الكمي لنقطة النهاية الذي يتطلب عمالة كثيفة. قامت طريقة 2-DDCT المقارنة (2001) بتوحيد التحديد الكمي النسبي، وتناولت إرشادات MIQE (2009) مشاكل قابلية التكرار واسعة الانتشار، ثم وسع تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي المجال نحو التحديد الكمي المطلق.

Debates

كيف ينبغي اختيار الجينات المرجعية للتطبيع؟

يفترض التحديد الكمي النسبي تعبيرًا مستقرًا للجين المرجعي عبر الظروف، ولكن الجينات المنزلية الفردية يمكن أن تختلف؛ يوصى باستخدام جينات مرجعية متعددة معتمدة لتجنب التطبيع المتحيز.

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Thomas Schmittgen
• Jim Huggett

Seminal works

• livak-2001
• bustin-2009
• huggett-2013

Frequently asked questions

ماذا يعني انخفاض قيمة Ct؟

يعني انخفاض دورة التحديد الكمي (Ct أو Cq) أن الفلورة تتجاوز العتبة مبكرًا، مما يشير إلى وجود المزيد من القالب المستهدف الأولي؛ يرتبط Ct عكسيًا بلوغاريتم الكمية الأولية.

كيف يختلف تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي عن تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي؟

يقسم تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي التفاعل إلى العديد من الأجزاء الصغيرة ويحسب عدد الأجزاء التي تحتوي على المستهدف، مما يعطي عددًا مطلقًا بدون منحنى قياسي، بينما يستنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي الكمية من دورة التحديد الكمي، عادةً كمقياس نسبي.