تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) وعلم النسخ (Transcriptomics)

يحدد تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) هوية ووفرة جزيئات الحمض النووي الريبوزي في عينة عن طريق التسلسل عالي الإنتاجية، مما يوفر صورة كمية وشاملة للجينوم لتعبير الجينات. علم النسخ هو دراسة هذه المجموعة الكاملة من النسخ، أو النسخوم (transcriptome)، وكيف تتغير بين الأنسجة والظروف وحالات المرض.

Definition

تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) هو طريقة تحول الحمض النووي الريبوزي إلى مكتبة من الشظايا المتسلسلة وتحسب القراءات المطابقة للجينات أو النسخ لتقدير التعبير عبر النسخوم، وهو المجموعة الكاملة من جزيئات الحمض النووي الريبوزي الموجودة في الخلية أو النسيج.

Scope

يغطي هذا الموضوع كيفية تحويل تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) لقراءات التسلسل إلى تقديرات للتعبير الجيني، ومعنى النسخوم كقراءة ديناميكية، ووحدات التقدير الشائعة، وقضايا الجودة والتوحيد القياسي الخاصة بالقياس القائم على التسلسل. إنه يتعامل مع تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) كمنصة قياس واكتشاف بدلاً من كونه بروتوكول اختبار سريري.

Core questions

• كيف يتم تحويل قراءات التسلسل إلى تقديرات تعبير كمية؟
• ما الذي يغطيه النسخوم بخلاف قائمة ثابتة من الجينات؟
• كيف يؤثر التطبيع وعمق القراءة على قابلية المقارنة؟
• كيف يتم تقييم دقة وقابلية تكرار تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq)؟

Key concepts

• النسخوم (Transcriptome)
• مطابقة القراءات وعدّها
• التطبيع (مثل قياس العمق والطول)
• التعبير التفاضلي
• ضوابط الإضافة (Spike-in controls)
• علم النسخ أحادي الخلية والكتلي

Mechanisms

يتم استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA)، ونسخه عكسيًا إلى الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (cDNA)، وتجزئته، وتحضيره في مكتبة تسلسل؛ ثم تتم محاذاة القراءات الناتجة مع جينوم مرجعي أو نسخوم، ويوفر عدد القراءات المتداخلة مع كل ميزة عددًا يتناسب مع تعبيرها (Mortazavi et al., 2008). نظرًا لأن عمق القراءة الكلي وطول النسخ يؤثران على الأعداد الخام، يتم تطبيع البيانات قبل مقارنة النسخ، وغالبًا ما يتم التعبير عن الوفرة بوحدات مقياس الطول والعمق. يمكن لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) اكتشاف نسخ جديدة، ومتغيرات الربط (splice variants)، ونطاق ديناميكي واسع للتعبير، مما يميزه عن طرق التنميط السابقة القائمة على التهجين (Wang et al., 2009). تُستخدم معايير الإضافة الخارجية (spike-in standards) ومقارنة المجموعات (consortium benchmarking) لتوصيف دقة المنصة وحدودها (Jiang et al., 2011; SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

Clinical relevance

يعتمد تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) بشكل متزايد على تحديد ملامح الأورام الجزيئية، واكتشاف الاندماج، والتصنيف القائم على التعبير، ويتطلب تفسير هذه البيانات فهم كيفية تحول الأعداد إلى تقديرات للتعبير. يصف هذا المدخل الطريقة وخصائصها الكمية؛ ولا يقدم تفسيرات تشخيصية أو إرشادات علاجية، والتي تعتمد على فحوصات معتمدة ومعايير سريرية.

Evidence & guidelines

تُستكمل الأوصاف التأسيسية لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) كطريقة كمية (Mortazavi et al., 2008; Wang et al., 2009) بجهود مجتمعية حول الدقة وقابلية التكرار، بما في ذلك معايير الإضافة الخارجية (Jiang et al., 2011) ومقارنة أداء تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) بواسطة SEQC/MAQC-III (2014).

History

انتقل قياس النسخوم من نهج علامات التسلسل المعبر عنها (expressed-sequence-tag) والمصفوفات الدقيقة (microarray) إلى التسلسل المباشر في أواخر العقد الأول من القرن الحادي والعشرين، عندما جعل تسلسل الجيل التالي عدّ قراءات النسخوم الكاملة عمليًا (Mortazavi et al., 2008). سرعان ما أصبح تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) معيارًا لدراسات التعبير، وتناولت أعمال المجموعات اللاحقة كيفية جعل قياساته قابلة للمقارنة والتكرار (SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

Debates

كيف ينبغي تطبيع أعداد تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) للمقارنة؟

تعتمد الأعداد الخام على عمق التسلسل وطول النسخ، ويمكن أن تؤدي خيارات التطبيع المختلفة إلى تغيير الجينات التي تظهر تعبيرًا تفاضليًا؛ ويظل اختيار التطبيع والضوابط المناسبة مصدر قلق منهجي.

Key figures

• Zhong Wang
• Michael Snyder
• Ali Mortazavi
• Barbara Wold

Seminal works

• wang-2009
• mortazavi-2008
• seqc-2014

Frequently asked questions

ما هو النسخوم؟

النسخوم هو المجموعة الكاملة من نسخ الحمض النووي الريبوزي الموجودة في خلية أو نسيج في وقت معين؛ ولأنه يتغير مع الحالة ونوع الخلية، فإن قياسه يوضح أي الجينات نشطة وبأي مستوى.

كيف يختلف تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) عن المصفوفات الدقيقة (microarrays) للتعبير؟

يقوم تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) بتسلسل الحمض النووي الريبوزي وعدّه مباشرة، لذلك يمكنه اكتشاف نسخ جديدة ومتغيرات الربط ويغطي نطاقًا ديناميكيًا واسعًا، بينما تقيس المصفوفات الدقيقة التهجين للمجسات المحددة مسبقًا وتقتصر على التسلسلات المعروفة.