تحليل التعبير الجيني الكمي

تحليل التعبير الجيني الكمي هو مجموعة من الأساليب الجزيئية المستخدمة لقياس مدى تعبير الجين في نسيج أو مجموعة خلايا، عن طريق تحديد كمية نسخ الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) أو منتجاتها البروتينية. ضمن علم الأمراض الجزيئي، يوفر هذا التحليل الدليل الرقمي الذي يربط النشاط الجزيئي للعينة بالتشخيص والتصنيف والإنذار.

Definition

تحليل التعبير الجيني الكمي هو قياس وفرة المنتجات الجينية (نسخ الحمض النووي الريبوزي أو البروتينات) في عينة بيولوجية، معبرًا عنها بمقياس نسبي أو مطلق، لتوصيف الحالة الجزيئية للخلايا أو الأنسجة.

Scope

يوجه هذا المجال القارئ عبر المنصات الكمية الرئيسية المستخدمة في علم الأمراض والطب المخبري: تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي والوقتي الحقيقي (real-time and quantitative PCR)، وتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA sequencing) وعلم النسخ (transcriptomics)، والكيمياء النسيجية المناعية (immunohistochemistry) وغيرها من طرق الكشف عن البروتين، وتوقيعات التعبير الجيني التنبؤية المستمدة من هذه القياسات، وممارسات ضمان الجودة التي تجعل الأرقام موثوقة. ويصنف هذه الأساليب كمنهجيات قياس بدلاً من كونها تعليمات سريرية.

Sub-topics

• بصمات التعبير الجيني والعلامات التنبؤية
• الكيمياء الهيستولوجية المناعية وطرق الكشف عن البروتينات
• ضمان الجودة في المقايسات الجزيئية الكمية
• تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي
• تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) وعلم النسخ (Transcriptomics)

Core questions

• كيف يتم قياس وتطبيع وفرة النسخ أو البروتين؟
• متى يكون القياس النسبي كافيًا ومتى يكون التحديد الكمي المطلق ضروريًا؟
• كيف تُترجم قياسات التعبير إلى تصنيف تشخيصي أو تنبؤي؟
• ما هي الضوابط والمعايير التي تجعل النتيجة الكمية قابلة للتكرار عبر المختبرات؟

Key concepts

• وفرة النسخ ووفرة البروتين
• التحديد الكمي النسبي مقابل المطلق
• التطبيع والجينات المرجعية
• توقيعات التعبير الجيني
• الصلاحية التحليلية وقابلية التكرار
• المراحل قبل التحليلية والتحليلية وبعد التحليلية

Mechanisms

تحول جميع طرق التعبير الكمي الكمية الجزيئية إلى إشارة قابلة للقياس تتناسب مع كمية الهدف. يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (Reverse-transcription quantitative PCR) بتضخيم الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المتمم (cDNA) ويقرأ الدورة التي تتجاوز فيها الفلورة عتبة معينة، مع الإبلاغ عن التحديد الكمي النسبي عادةً باستخدام منهج 2-DDCT المقارن (Livak & Schmittgen, 2001). يقوم تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA sequencing) بحساب القراءات المطابقة للنسخ، محولًا عمق التسلسل إلى تقديرات للتعبير (Wang et al., 2009). تكشف الكيمياء النسيجية المناعية (Immunohistochemistry) عن البروتين باستخدام أجسام مضادة معلمة وتقدم تقارير عن شدة التلوين ومداه. عبر المنصات، يجب تطبيع الإشارة الخام إلى معايير مرجعية بحيث يمكن فصل الاختلافات البيولوجية عن التباين التقني، وهو مطلب تم إضفاء الطابع الرسمي عليه لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) بواسطة إرشادات MIQE (Bustin et al., 2009).

Clinical relevance

تدعم قياسات التعبير الكمي تصنيف الأورام الجزيئي، والإبلاغ عن المؤشرات الحيوية، واختبارات التنبؤ متعددة الجينات، وتعد قراءتها بشكل نقدي جزءًا من ممارسة الطب المخبري. يصف هذا المدخل كيفية توليد وتفسير هذه القياسات كمجال منهجي؛ وهو ليس مصدرًا للعتبات التشخيصية أو قرارات العلاج، التي تنتمي إلى الفحوصات السريرية المعتمدة والإرشادات السريرية.

Evidence & guidelines

يشمل الأدب المنهجي معايير الإبلاغ مثل إرشادات MIQE لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) (Bustin et al., 2009)، والأوصاف التأسيسية لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq) كمنصة كمية (Wang et al., 2009; Mortazavi et al., 2008)، والعروض التوضيحية البارزة التي تشير إلى أن ملفات التعبير تحمل معلومات تنبؤية (van 't Veer et al., 2002). تحدد هذه الدراسات مجتمعة كلًا من التقنيات والمعايير التي يتم بموجبها الحكم على نتائجها.

History

تطور تحليل التعبير الكمي من تقنيات النقل الشمالي (Northern blots) ذات الإنتاجية المنخفضة وتفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) المبكر نحو تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) في التسعينيات، وتحديد الملامح القائم على المصفوفات الدقيقة (microarray-based profiling) حوالي عام 2000، وتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA sequencing) عالي الإنتاجية منذ أواخر العقد الأول من القرن الحادي والعشرين. أظهرت دراسة تحديد ملامح سرطان الثدي لعام 2002 (van 't Veer et al.) أن أنماط التعبير يمكن أن تتنبأ بالنتائج، وشكلت إرشادات MIQE لعام 2009 تحولًا نحو التحديد الكمي الموحد والقابل للتكرار.

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Laura van 't Veer

Seminal works

• bustin-2009
• wang-2009
• vantveer-2002
• livak-2001

Frequently asked questions

ما الفرق بين التحديد الكمي النسبي والمطلق؟

يقارن التحديد الكمي النسبي تعبير الهدف بمرجع (على سبيل المثال، طريقة 2-DDCT المقارنة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي)، بينما يبلغ التحديد الكمي المطلق عن عدد نسخ حقيقي أو تركيز مقابل معيار معاير. تستخدم معظم دراسات التعبير مقاييس نسبية؛ تتطلب المقاييس المطلقة معايرة إضافية.

لماذا يعد التطبيع ضروريًا في تحليل التعبير؟

تعكس الإشارة الخام كلاً من التعبير البيولوجي والعوامل التقنية مثل كمية المدخلات والكفاءة وعمق التسلسل؛ يزيل التطبيع للجينات المرجعية أو المعايير المكون التقني بحيث تعكس الاختلافات المقاسة بيولوجيا حقيقية.