Đảm bảo chất lượng trong các xét nghiệm phân tử định lượng

Đảm bảo chất lượng trong các xét nghiệm phân tử định lượng là hệ thống các tiêu chuẩn, kiểm soát và thực hành báo cáo nhằm giúp các phép đo biểu hiện gen trở nên chính xác, có thể tái lập và có thể so sánh được giữa các lần chạy và các phòng thí nghiệm. Nếu không có nó, một kết quả số từ qPCR, RNA-seq hoặc xét nghiệm đa gen không thể đáng tin cậy hoặc so sánh được.

Definition

Đảm bảo chất lượng trong các xét nghiệm phân tử định lượng là việc sử dụng phối hợp các quy trình chuẩn hóa, kiểm soát, vật liệu tham chiếu và báo cáo minh bạch để đảm bảo rằng các phép đo biểu hiện gen hoặc protein có giá trị phân tích và có thể tái lập.

Scope

Chủ đề này bao gồm các nguồn biến thiên tiền phân tích, phân tích và hậu phân tích trong các xét nghiệm định lượng, vai trò của vật liệu tham chiếu và kiểm soát spike-in, chức năng của các tiêu chuẩn báo cáo như MIQE, và các nghiên cứu đánh giá chuẩn của liên minh đã thiết lập khả năng tái lập của nền tảng. Nó được trình bày như một chủ đề về phương pháp luận và tiêu chuẩn, không phải là quy trình vận hành phòng thí nghiệm hoặc sổ tay công nhận.

Core questions

• Các nguồn lỗi tiền phân tích, phân tích và hậu phân tích là gì?
• Vật liệu tham chiếu và kiểm soát neo một phép đo định lượng như thế nào?
• Tại sao báo cáo minh bạch lại quan trọng đối với khả năng tái lập?
• Khả năng tái lập của một nền tảng đo lường được chứng minh như thế nào?

Key concepts

• Các giai đoạn tiền phân tích, phân tích và hậu phân tích
• Vật liệu tham chiếu và chất hiệu chuẩn
• Kiểm soát spike-in và quy trình
• Tiêu chuẩn báo cáo (ví dụ: MIQE)
• Khả năng tái lập giữa các phòng thí nghiệm
• Giá trị phân tích

Mechanisms

Sự biến thiên xuất hiện trong một xét nghiệm định lượng ở mọi giai đoạn: thu thập mẫu và tính toàn vẹn của RNA (tiền phân tích), hiệu quả khuếch đại, độ sâu giải trình tự, hiệu suất kháng thể và sự trôi dạt giữa các lần chạy (phân tích), và chuẩn hóa, ngưỡng và diễn giải (hậu phân tích). Đảm bảo chất lượng chống lại những điều này bằng cách cố định các quy trình, bao gồm các kiểm soát dương tính, âm tính và quy trình, và neo các phép đo vào vật liệu tham chiếu và tiêu chuẩn spike-in để tín hiệu có thể được hiệu chuẩn. Báo cáo minh bạch các yếu tố này, theo yêu cầu của hướng dẫn MIQE và MIQE kỹ thuật số (Bustin et al., 2009; Huggett et al., 2013), cho phép người khác đánh giá và tái lập kết quả. Các nghiên cứu đa phòng thí nghiệm lớn chứng minh khả năng tái lập có thể đạt được của các nền tảng microarray và RNA-seq và xác định các thực hành hỗ trợ nó (MAQC Consortium, 2006; SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

Clinical relevance

Đảm bảo chất lượng đáng tin cậy là yếu tố cho phép các phép đo phân tử được sử dụng trong báo cáo chẩn đoán và tiên lượng, và việc nhận biết các thành phần của nó giúp đánh giá độ tin cậy của một kết quả. Mục này mô tả các nguyên tắc và tiêu chuẩn chất lượng ở cấp độ phương pháp luận và không cấu thành một giao thức phòng thí nghiệm lâm sàng, yêu cầu công nhận hoặc cơ sở để quản lý bệnh nhân.

Evidence & guidelines

Các tiêu chuẩn báo cáo cho PCR định lượng và PCR kỹ thuật số được xác định bởi hướng dẫn MIQE và MIQE kỹ thuật số (Bustin et al., 2009; Huggett et al., 2013). Khả năng tái lập của các nền tảng biểu hiện được ghi nhận bởi dự án Kiểm soát chất lượng MicroArray (MAQC Consortium, 2006) và nghiên cứu Kiểm soát chất lượng giải trình tự cho RNA-seq (SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

History

Khi các xét nghiệm phân tử định lượng lan rộng vào những năm 2000, mối lo ngại về các kết quả không thể tái lập đã thúc đẩy việc chuẩn hóa phối hợp. Dự án MAQC (2006) đã kiểm tra khả năng tái lập của microarray giữa các phòng thí nghiệm, hướng dẫn MIQE (2009) đã chuẩn hóa báo cáo qPCR, và các nỗ lực sau đó đã mở rộng điều này sang PCR kỹ thuật số (2013) và RNA-seq (2014), thiết lập đảm bảo chất lượng như một lĩnh vực trong phân tích biểu hiện định lượng.

Debates

Các phép đo có thể so sánh được như thế nào giữa các nền tảng và phòng thí nghiệm?

Ngay cả với các kiểm soát, các giá trị tuyệt đối có thể khác nhau giữa các nền tảng và địa điểm, vì vậy trọng tâm được đặt vào các so sánh tương đối, vật liệu tham chiếu chung và báo cáo minh bạch; mức độ hài hòa các kết quả giữa các nền tảng vẫn là một câu hỏi phương pháp luận mở.

Key figures

• Stephen Bustin
• Jim Huggett
• Leming Shi

Seminal works

• bustin-2009
• maqc-2006
• seqc-2014

Frequently asked questions

Sự khác biệt giữa vật liệu tham chiếu và kiểm soát trong xét nghiệm phân tử là gì?

Vật liệu tham chiếu là một tiêu chuẩn đã được đặc trưng được sử dụng để hiệu chuẩn hoặc neo một phép đo, trong khi kiểm soát là một mẫu được chạy cùng với các mẫu thử nghiệm để xác nhận rằng xét nghiệm đang hoạt động như mong đợi; cả hai đều đóng góp vào đảm bảo chất lượng nhưng phục vụ các vai trò khác nhau.

Tại sao các tiêu chuẩn báo cáo như MIQE lại quan trọng?

Các tiêu chuẩn quy định các chi tiết thử nghiệm phải được công bố để một kết quả định lượng có thể được đánh giá và tái lập bởi những người khác; nếu không có chúng, sự khác biệt giữa các nghiên cứu có thể phản ánh sự biến thiên kỹ thuật không được ghi lại hơn là sinh học.