Giải trình tự RNA và Phân tích hệ phiên mã

Giải trình tự RNA (RNA-seq) xác định danh tính và số lượng các phân tử RNA trong một mẫu bằng cách giải trình tự thông lượng cao, cung cấp một bức tranh định lượng, toàn bộ hệ gen về biểu hiện gen. Phân tích hệ phiên mã là nghiên cứu về tập hợp hoàn chỉnh các bản phiên mã này, tức là hệ phiên mã, và cách nó thay đổi giữa các mô, điều kiện và trạng thái bệnh.

Definition

Giải trình tự RNA là một phương pháp chuyển đổi RNA thành một thư viện các đoạn đã được giải trình tự và đếm các đọc được ánh xạ tới các gen hoặc bản phiên mã để định lượng biểu hiện trên toàn bộ hệ phiên mã, tức là tập hợp hoàn chỉnh các phân tử RNA có trong một tế bào hoặc mô.

Scope

Chủ đề này bao gồm cách RNA-seq chuyển đổi các đọc trình tự thành ước tính biểu hiện, ý nghĩa của hệ phiên mã như một chỉ số động, các đơn vị định lượng phổ biến, và các vấn đề về chất lượng và tiêu chuẩn hóa đặc trưng cho phép đo dựa trên giải trình tự. Nó coi RNA-seq là một nền tảng đo lường và khám phá hơn là một giao thức xét nghiệm lâm sàng.

Core questions

• Các đọc trình tự được chuyển đổi thành ước tính biểu hiện định lượng như thế nào?
• Hệ phiên mã thu được những gì ngoài một danh sách gen cố định?
• Chuẩn hóa và độ sâu đọc ảnh hưởng đến khả năng so sánh như thế nào?
• Độ chính xác và khả năng tái lập của RNA-seq được đánh giá như thế nào?

Key concepts

• Hệ phiên mã
• Ánh xạ và đếm đọc
• Chuẩn hóa (ví dụ: điều chỉnh độ sâu và độ dài)
• Biểu hiện khác biệt
• Kiểm soát spike-in
• Phân tích hệ phiên mã đơn bào và khối

Mechanisms

RNA được chiết tách, phiên mã ngược thành cDNA, phân đoạn và chuẩn bị thành một thư viện giải trình tự; các đọc thu được được căn chỉnh với một bộ gen hoặc hệ phiên mã tham chiếu, và số lượng đọc chồng lấp với mỗi đặc điểm cung cấp một số lượng tỷ lệ với biểu hiện của nó (Mortazavi et al., 2008). Vì tổng độ sâu đọc và độ dài bản phiên mã ảnh hưởng đến số lượng thô, dữ liệu được chuẩn hóa trước khi các bản phiên mã có thể được so sánh, và số lượng thường được biểu thị bằng các đơn vị được điều chỉnh theo độ dài và độ sâu. RNA-seq có thể phát hiện các bản phiên mã mới, các biến thể nối và một dải động biểu hiện rộng, phân biệt nó với các phương pháp tạo hồ sơ dựa trên lai hóa trước đây (Wang et al., 2009). Các tiêu chuẩn spike-in bên ngoài và đánh giá chuẩn của các tổ chức được sử dụng để đặc trưng hóa độ chính xác và giới hạn của nền tảng (Jiang et al., 2011; SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

Clinical relevance

RNA-seq ngày càng là nền tảng cho việc tạo hồ sơ khối u phân tử, phát hiện gen hợp nhất và phân loại dựa trên biểu hiện, và việc diễn giải dữ liệu như vậy đòi hỏi phải hiểu cách các số lượng trở thành ước tính biểu hiện. Mục này mô tả phương pháp và các đặc tính định lượng của nó; nó không cung cấp các diễn giải chẩn đoán hoặc hướng dẫn điều trị, vốn dựa trên các xét nghiệm đã được xác nhận và các tiêu chí lâm sàng.

Evidence & guidelines

Các mô tả cơ bản về RNA-seq như một phương pháp định lượng (Mortazavi et al., 2008; Wang et al., 2009) được bổ sung bởi các nỗ lực của cộng đồng về độ chính xác và khả năng tái lập, bao gồm các tiêu chuẩn spike-in bên ngoài (Jiang et al., 2011) và đánh giá chuẩn SEQC/MAQC-III về hiệu suất RNA-seq (2014).

History

Việc đo lường hệ phiên mã đã chuyển từ các phương pháp thẻ trình tự biểu hiện và microarray sang giải trình tự trực tiếp vào cuối những năm 2000, khi giải trình tự thế hệ tiếp theo làm cho việc đếm đọc toàn bộ hệ phiên mã trở nên khả thi (Mortazavi et al., 2008). RNA-seq nhanh chóng trở thành một tiêu chuẩn cho các nghiên cứu biểu hiện, và công việc của các tổ chức sau đó đã giải quyết cách làm cho các phép đo của nó có thể so sánh và tái lập (SEQC/MAQC-III Consortium, 2014).

Debates

Các số lượng RNA-seq nên được chuẩn hóa như thế nào để so sánh?

Số lượng thô phụ thuộc vào độ sâu giải trình tự và độ dài bản phiên mã, và các lựa chọn chuẩn hóa khác nhau có thể thay đổi các gen xuất hiện biểu hiện khác biệt; việc lựa chọn chuẩn hóa và kiểm soát phù hợp vẫn là một mối quan tâm về phương pháp luận.

Key figures

• Zhong Wang
• Michael Snyder
• Ali Mortazavi
• Barbara Wold

Seminal works

• wang-2009
• mortazavi-2008
• seqc-2014

Frequently asked questions

Hệ phiên mã là gì?

Hệ phiên mã là tập hợp hoàn chỉnh các bản phiên mã RNA có trong một tế bào hoặc mô tại một thời điểm nhất định; vì nó thay đổi theo điều kiện và loại tế bào, việc đo lường nó cho thấy gen nào đang hoạt động và ở mức độ nào.

RNA-seq khác với microarray để biểu hiện như thế nào?

RNA-seq giải trình tự và đếm RNA trực tiếp, do đó nó có thể phát hiện các bản phiên mã mới và các biến thể nối và bao phủ một dải động rộng, trong khi microarray đo lường sự lai hóa với các đầu dò được xác định trước và bị giới hạn ở các trình tự đã biết.