Phân tích định lượng thời gian thực và đánh giá số lượng bản sao

Các phương pháp phân tử định lượng đo lường lượng axit nucleic mục tiêu hiện diện, thay vì chỉ đơn thuần là liệu nó có thể phát hiện được hay không. PCR định lượng thời gian thực theo dõi quá trình khuếch đại khi nó diễn ra, PCR kỹ thuật số phân chia mẫu để đếm các phân tử một cách tuyệt đối, và đánh giá số lượng bản sao xác định liệu một vùng gen có được tăng lên hay mất đi hay không.

Definition

Phân tích định lượng thời gian thực đo lường lượng axit nucleic mục tiêu, thường bằng cách theo dõi tín hiệu huỳnh quang trong quá trình khuếch đại (PCR thời gian thực) hoặc bằng cách đếm các phân vùng dương tính (PCR kỹ thuật số); đánh giá số lượng bản sao xác định số lượng bản sao của một vùng gen so với một tham chiếu.

Scope

Chủ đề này bao gồm PCR thời gian thực (định lượng), PCR kỹ thuật số và PCR kỹ thuật số giọt, cùng với các phương pháp tiếp cận để đánh giá số lượng bản sao. Nó đề cập đến các nguyên tắc định lượng và các yếu tố cần cân nhắc để kết quả có thể so sánh được, được trình bày dưới dạng tài liệu tham khảo về phương pháp luận hơn là hướng dẫn xét nghiệm lâm sàng.

Key concepts

• PCR thời gian thực (định lượng)
• Chu kỳ định lượng (Cq) và hiệu quả khuếch đại
• Đường chuẩn và định lượng tương đối
• PCR kỹ thuật số và PCR kỹ thuật số giọt
• Định lượng tuyệt đối bằng cách phân vùng
• Tăng và mất số lượng bản sao
• Tiêu chuẩn báo cáo và khả năng tái lập

Mechanisms

PCR thời gian thực kết hợp quá trình khuếch đại với một chất phát huỳnh quang mà tín hiệu của nó tăng lên tỷ lệ thuận với sự tích lũy sản phẩm; chu kỳ mà tín hiệu vượt qua ngưỡng phản ánh lượng mục tiêu ban đầu, cho phép định lượng tương đối hoặc theo đường chuẩn (Heid et al., 1996). PCR kỹ thuật số thay vào đó phân phối mẫu vào nhiều phân vùng nhỏ để mỗi phân vùng chứa không hoặc một vài phân tử; việc đếm tỷ lệ các phân vùng dương tính và áp dụng thống kê Poisson sẽ cho ra một số lượng tuyệt đối mà không cần đường chuẩn (Hindson et al., 2011). Đánh giá số lượng bản sao so sánh sự phong phú của một vùng mục tiêu với một tham chiếu để phát hiện sự khuếch đại hoặc xóa bỏ, một ý tưởng được tiên phong bởi lai hóa bộ gen so sánh (Kallioniemi et al., 1992).

Clinical relevance

Các phương pháp định lượng và số lượng bản sao được sử dụng để đo tải lượng mầm bệnh, biểu hiện gen và sự tăng hoặc mất gen. Mục này giải thích cách định lượng hoạt động như một tài liệu tham khảo về phương pháp luận; nó không đưa ra lời khuyên về việc lựa chọn, diễn giải hoặc hành động dựa trên bất kỳ xét nghiệm định lượng cụ thể nào trong chăm sóc bệnh nhân.

Evidence & guidelines

Việc báo cáo PCR định lượng được hướng dẫn bởi các khuyến nghị MIQE, trong đó quy định thông tin tối thiểu cần thiết cho việc công bố có thể tái lập (Bustin et al., 2009). Các nghiên cứu sơ cấp cơ bản mô tả định lượng thời gian thực (Heid et al., 1996), định lượng kỹ thuật số tuyệt đối (Hindson et al., 2011) và đo lường số lượng bản sao trên toàn bộ bộ gen (Kallioniemi et al., 1992).

History

PCR thời gian thực vào giữa những năm 1990 đã biến quá trình khuếch đại từ một công cụ định tính thành một công cụ định lượng (Heid et al., 1996), và các tiêu chuẩn báo cáo đồng thuận đã ra đời một thập kỷ sau đó (Bustin et al., 2009). PCR kỹ thuật số, và đặc biệt là PCR kỹ thuật số giọt, sau đó đã cho phép đếm tuyệt đối các phân tử với độ chính xác cao (Hindson et al., 2011), trong khi đánh giá số lượng bản sao đã phát triển từ lai hóa bộ gen so sánh sang các phương pháp dựa trên mảng và giải trình tự (Kallioniemi et al., 1992).

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

PCR kỹ thuật số khác với PCR định lượng thời gian thực như thế nào?

PCR thời gian thực ước tính lượng mục tiêu ban đầu từ thời điểm tín hiệu huỳnh quang vượt qua ngưỡng, thường là so với một tiêu chuẩn, trong khi PCR kỹ thuật số phân chia mẫu và đếm các ngăn dương tính để đưa ra số lượng phân tử tuyệt đối mà không cần đường chuẩn.

Đánh giá số lượng bản sao đo lường điều gì?

Nó xác định có bao nhiêu bản sao của một vùng gen cụ thể hiện diện so với một tham chiếu, xác định sự khuếch đại (tăng) hoặc xóa bỏ (mất) của vùng đó.