Ứng dụng PCR thời gian thực và PCR định lượng

PCR thời gian thực, còn được gọi là PCR định lượng (qPCR), đo lường sự tích lũy DNA được khuếch đại theo từng chu kỳ thông qua tín hiệu huỳnh quang, cho phép ước tính lượng ban đầu của một trình tự mục tiêu. Kết hợp với phiên mã ngược (RT-qPCR), đây là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để định lượng biểu hiện gen trong bệnh học phân tử.

Definition

PCR định lượng thời gian thực là một phương pháp khuếch đại axit nucleic giám sát sự hình thành sản phẩm theo thời gian thực thông qua huỳnh quang, sử dụng chu kỳ định lượng để ước tính số lượng ban đầu của mục tiêu DNA hoặc (sau phiên mã ngược) RNA.

Scope

Chủ đề này bao gồm nguyên lý đo lường của PCR thời gian thực, chu kỳ định lượng (Cq) và mối quan hệ của nó với lượng khuôn mẫu, định lượng tương đối bằng phương pháp 2-DDCT so sánh, vai trò của gen tham chiếu và hiệu quả khuếch đại, cũng như các tiêu chuẩn báo cáo chi phối khả năng tái lập. Nó cũng đề cập đến PCR kỹ thuật số như một phương pháp định lượng tuyệt đối liên quan. Nó đề cập đến những điều này như các phương pháp phòng thí nghiệm, không phải là các giao thức xét nghiệm lâm sàng.

Core questions

• Chu kỳ định lượng liên quan đến lượng khuôn mẫu ban đầu như thế nào?
• Biểu hiện tương đối được tính toán và chuẩn hóa trong RT-qPCR như thế nào?
• Tại sao hiệu quả khuếch đại và lựa chọn gen tham chiếu lại ảnh hưởng đến kết quả?
• PCR kỹ thuật số khác với PCR thời gian thực trong việc đạt được định lượng như thế nào?

Key concepts

• Chu kỳ định lượng (Cq / Ct)
• Hiệu quả khuếch đại
• Phương pháp 2-DDCT so sánh
• Gen tham chiếu (housekeeping)
• qPCR phiên mã ngược
• PCR kỹ thuật số và phân vùng
• Tiêu chuẩn báo cáo MIQE

Mechanisms

Trong quá trình PCR, trình tự mục tiêu tăng gấp đôi mỗi chu kỳ trong pha lũy thừa, và một chất báo cáo huỳnh quang (thuốc nhuộm xen kẽ hoặc đầu dò đặc hiệu trình tự) phát ra tín hiệu tỷ lệ thuận với sản phẩm tích lũy. Chu kỳ mà tại đó huỳnh quang vượt qua ngưỡng xác định (chu kỳ định lượng, Cq hoặc Ct) tỷ lệ nghịch với logarit của lượng khuôn mẫu ban đầu, do đó Cq thấp hơn có nghĩa là có nhiều mục tiêu hơn. Biểu hiện tương đối thường được tính toán bằng phương pháp 2-DDCT so sánh, phương pháp này chuẩn hóa Cq của mục tiêu theo một gen tham chiếu và một mẫu hiệu chuẩn, giả định hiệu quả khuếch đại gần như bằng nhau (Livak & Schmittgen, 2001). Bởi vì hiệu quả, sự ổn định của gen tham chiếu và sự biến đổi của phiên mã ngược đều ảnh hưởng đến ước tính, các hướng dẫn MIQE chỉ định các chi tiết thực nghiệm và xác nhận cần thiết để một kết quả có thể được giải thích (Bustin et al., 2009). PCR kỹ thuật số thay vào đó chia mẫu thành nhiều phản ứng và đếm các phần dương tính, cho phép định lượng tuyệt đối mà không cần đường chuẩn (Huggett et al., 2013).

Clinical relevance

RT-qPCR là một nền tảng thường quy để đo mức độ phiên mã đằng sau các kết quả chẩn đoán và tiên lượng phân tử, và việc hiểu các giả định của nó là một phần của việc giải thích các báo cáo phòng thí nghiệm. Mục này giải thích phương pháp và các hạn chế của nó và không phải là cơ sở cho các ngưỡng chẩn đoán hoặc quản lý bệnh nhân, những điều này phụ thuộc vào các xét nghiệm đã được xác nhận.

Evidence & guidelines

Các kỳ vọng về báo cáo và chất lượng đối với PCR thời gian thực được nêu trong hướng dẫn MIQE (Bustin et al., 2009) và, đối với PCR kỹ thuật số, hướng dẫn MIQE kỹ thuật số (Huggett et al., 2013). Phương pháp 2-DDCT so sánh (Livak & Schmittgen, 2001) vẫn là tài liệu tham khảo tiêu chuẩn cho định lượng tương đối.

History

PCR thời gian thực xuất hiện vào những năm 1990 khi phát hiện huỳnh quang được kết hợp với chu trình nhiệt, thay thế việc định lượng điểm cuối tốn nhiều công sức. Phương pháp 2-DDCT so sánh (2001) đã chuẩn hóa định lượng tương đối, hướng dẫn MIQE (2009) đã giải quyết các vấn đề tái lập rộng rãi, và PCR kỹ thuật số sau đó đã mở rộng lĩnh vực này hướng tới định lượng tuyệt đối.

Debates

Nên chọn gen tham chiếu để chuẩn hóa như thế nào?

Định lượng tương đối giả định biểu hiện gen tham chiếu ổn định trong các điều kiện, nhưng các gen housekeeping đơn lẻ có thể thay đổi; việc sử dụng nhiều gen tham chiếu đã được xác nhận được khuyến nghị để tránh chuẩn hóa sai lệch.

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Thomas Schmittgen
• Jim Huggett

Seminal works

• livak-2001
• bustin-2009
• huggett-2013

Frequently asked questions

Giá trị Ct thấp hơn có nghĩa là gì?

Chu kỳ định lượng (Ct hoặc Cq) thấp hơn có nghĩa là huỳnh quang vượt ngưỡng sớm hơn, điều này cho thấy có nhiều khuôn mẫu mục tiêu ban đầu hơn; Ct tỷ lệ nghịch với logarit của lượng ban đầu.

PCR kỹ thuật số khác với qPCR thời gian thực như thế nào?

PCR kỹ thuật số chia phản ứng thành nhiều ngăn nhỏ và đếm số lượng ngăn chứa mục tiêu, cho ra số lượng tuyệt đối mà không cần đường chuẩn, trong khi qPCR thời gian thực suy ra số lượng từ chu kỳ định lượng, thường là một phép đo tương đối.