PCR ve Nükleik Asit Çoğaltma Teknikleri
Nükleik asit çoğaltma teknikleri, eser miktarda bulunan bir hedefin saptanabilir ve ölçülebilir hale gelmesi için seçilen bir DNA veya RNA dizisini birçok kez kopyalar. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bu tekniklerin prototipidir: denatürasyon, primer bağlanması ve polimeraz uzaması döngülerinin tekrarı yoluyla, tanımlanmış bir dizide üstel bir artış sağlayarak moleküler tanının temel taşlarından biri haline gelmektedir.
Tanım
Nükleik asit çoğaltma teknikleri, belirli bir DNA veya RNA dizisinin enzimatik olarak birçok kopyasını üreten in vitro yöntemlerdir; PCR ise iki primer tarafından tanımlanan bir bölgeyi çoğaltmak için termal döngü ve bir DNA polimeraz kullanmaktadır.
Kapsam
Bu konu, geleneksel uç nokta PCR'ı, gerçek zamanlı (kantitatif) PCR'ı, RNA hedefleri için ters transkripsiyon PCR'ı ve döngü aracılı izotermal amplifikasyon gibi izotermal alternatifleri kapsamaktadır. Amplifikasyonun prensiplerini, bileşenlerini ve raporlama hususlarını metodolojik bir referans olarak ele almakta olup, test protokolleri veya klinik rehberlik sağlamamaktadır.
Anahtar kavramlar
- Termal döngü (denatürasyon, bağlanma, uzama)
- Primerler ve DNA polimeraz
- Üstel çoğaltma
- RNA hedefleri için ters transkripsiyon PCR
- Gerçek zamanlı (kantitatif) PCR
- İzotermal çoğaltma (örn. LAMP)
- Kontaminasyon kontrolü ve yanlış pozitifler
Mekanizmalar
PCR'da, çift sarmallı DNA ısı ile tek sarmallara denatüre edilmekte, kısa oligonükleotit primerler hedefin yanındaki dizilere bağlanmakta ve termostabil bir DNA polimeraz primerleri uzatarak yeni tamamlayıcı sarmallar sentezlemektedir; döngünün tekrarlanması her turda hedefi iki katına çıkararak üstel çoğaltma sağlamaktadır (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). RNA hedefleri, çoğaltmadan önce ters transkriptaz ile tamamlayıcı DNA'ya dönüştürülmektedir. Gerçek zamanlı PCR, floresan raportörler kullanarak ürün birikimini döngü döngü izlemekte ve kantifikasyona olanak tanımaktadır (Heid et al., 1996). Döngü aracılı izotermal amplifikasyon gibi izotermal yöntemler, tek bir sıcaklıkta çoğaltma yaparak termal döngü ihtiyacını ortadan kaldırmaktadır (Notomi et al., 2000).
Klinik önem
Çoğaltma teknikleri, tanı laboratuvarlarında patojenleri saptamak ve genetik hedefleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu madde, çoğaltmanın nasıl çalıştığını ve performansının nasıl raporlandığını açıklamaktadır; metodolojik bir referans olup, hasta bakımında belirli bir testin sipariş edilmesi veya yorumlanması için rehberlik sağlamamaktadır.
Kanıt ve kılavuzlar
MIQE kılavuzları (Bustin et al., 2009), kantitatif gerçek zamanlı PCR deneylerini raporlamak için gereken minimum bilgiyi belirlemekte ve şeffaflık ile tekrarlanabilirlik için yaygın olarak atıfta bulunulan bir referanstır. Temel birincil çalışmalar, orijinal PCR yöntemini ve gerçek zamanlı kantifikasyonu tanımlarken (Saiki et al., 1985; Heid et al., 1996), sonraki çalışmalar izotermal alternatifleri tanıtmıştır (Notomi et al., 2000).
Tarihçe
PCR, Kary Mullis tarafından tasarlanmış ve ilk olarak 1985 yılında Saiki ve arkadaşları tarafından orak hücre mutasyonunun saptanması gibi bir tanı problemine uygulanmış, yöntem 1986'da resmi olarak tanımlanmıştır (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). Termostabil polimerazların tanıtılması süreci otomatikleştirmiş, 1990'larda gerçek zamanlı saptama kantitatif yetenek eklemiştir (Heid et al., 1996). İzotermal teknikler daha sonra çoğaltmayı termal döngüleyicisi olmayan ortamlara genişletmiştir (Notomi et al., 2000).
Öne çıkan isimler
- Kary Mullis
- Randall Saiki
- Henry Erlich
İlgili konular
Temel eserler
- saiki-1985
- heid-1996
- bustin-2009
Sıkça sorulan sorular
- PCR neden bir hedefi üstel olarak çoğaltır?
- Her döngü, hedefin mevcut her sarmalını kopyalar, bu nedenle kopya sayısı her turda yaklaşık olarak iki katına çıkar; birçok döngüden sonra birkaç molekül olarak başlayan bir dizi milyarlarca kopyaya ulaşabilmektedir.
- İzotermal çoğaltma PCR'dan nasıl farklıdır?
- Döngü aracılı izotermal çoğaltma gibi izotermal yöntemler, özel primerler ve enzimler kullanarak DNA'yı tek bir sabit sıcaklıkta çoğaltır, bu da geleneksel PCR'ın gerektirdiği tekrarlayan ısıtma ve soğutma döngülerine olan ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır.