DNA ve RNA Dizileme Yöntemleri
Dizileme yöntemleri, DNA'daki veya dönüşüm sonrası RNA'daki nükleotitlerin kesin sırasını belirlemektedir. Sanger'in zincir sonlandırma kimyasından, yüksek paralel yeni nesil platformlara kadar, bu teknikler moleküler patolojinin genleri baz baz okumasına, mutasyonları tespit etmesine ve gen ekspresyonunu büyük ölçekte profillemesine olanak tanımaktadır.
Tanım
DNA ve RNA dizileme yöntemleri, bir nükleik asit molekülündeki nükleotit bazlarının doğrusal sırasını okuyan laboratuvar teknikleridir; RNA, dizilemeden önce tipik olarak tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) ters transkripsiyon yoluyla dönüştürülmektedir.
Kapsam
Bu konu, birinci nesil (Sanger) dizilemeyi, yeni nesil (yüksek paralel) dizilemeyi ve transkriptom analizi için RNA dizilemeyi, ayrıca kütüphane hazırlığı, dizileme ve okuma hizalamasının genel iş akışını kapsamaktadır. Bu bilgiler, klinik test rehberliği olmaktan ziyade, metodolojik bir referans materyali olarak sunulmaktadır.
Anahtar kavramlar
- Zincir sonlandırma (Sanger) dizilemesi
- Yeni nesil / yüksek paralel dizileme
- Kütüphane hazırlığı
- Dizileme okumaları ve kapsamı
- Okuma hizalaması ve varyant çağrısı
- RNA dizilemesi (transkriptomik)
- Hedefe yönelik, ekzom ve tüm genom dizilemesi
Mekanizmalar
Sanger dizilemesi, her uzunlukta fragman üretmek için zincir sonlandırıcı dideoksinükleotitleri içermekte ve bu fragmanlar, diziyi yeniden oluşturmak üzere boyuta göre ayrılmaktadır (Sanger et al., 1977). Yeni nesil dizileme ise bunun yerine parçalanmış DNA'dan bir kütüphane hazırlamakta, bunu uzamsal olarak amplifiye etmekte ve milyonlarca fragmanı paralel olarak dizilemekte, sinyalleri bilgisayar ortamında birleştirilen kısa dizileri okumaktadır (Margulies et al., 2005; Goodwin et al., 2016). RNA dizilemesi, RNA'dan türetilen tamamlayıcı DNA'ya aynı paralel yaklaşımı uygulamakta, transkriptleri nicelendirmekte ve ekleme (splicing) ile ekspresyon paternlerini ortaya koymaktadır (Wang et al., 2009). Okumalar, varyantları tanımlamak veya bolluğu ölçmek için bir referansa hizalanmaktadır.
Klinik önem
Dizileme, hastalıkla ilişkili varyantların tespitini ve tümörlerin ve patojenlerin moleküler karakterizasyonunu desteklemektedir. Bu madde, yöntemlerin dizi verilerini nasıl ürettiğini açıklamakta ve bir referans olarak tasarlanmıştır; bireysel hasta bakımında dizileme testlerinin seçilmesi, yorumlanması veya bunlara göre hareket edilmesi konusunda tavsiye içermemektedir.
Kanıt ve kılavuzlar
Bu yöntemler, Sanger'in 1977 zincir sonlandırma yönteminden başlayarak ilk yüksek verimli pikolitre platformuna (Margulies et al., 2005) ve insan genom dizisine (Venter et al., 2001) kadar uzanan temel birincil literatüre dayanmaktadır; daha sonraki derlemeler ise on yıllık yeni nesil teknolojileri ve RNA-Seq'in yükselişini incelemektedir (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).
Tarihçe
Sanger'in zincir sonlandırma yöntemi (1977), DNA dizilemesini rutin hale getirmiş ve insan genomunun ilk dizilenmesinin temelini oluşturmuştur (Venter et al., 2001). 2000'li yılların ortalarında yüksek paralel dizilemenin kullanıma girmesi, maliyeti önemli ölçüde düşürmüş ve verimi artırmıştır (Margulies et al., 2005); bir on yıl içinde ise yeni nesil dizileme ve RNA-Seq, genomik ve transkriptomik için standart araçlar haline gelmiştir (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).
Öne çıkan isimler
- Frederick Sanger
- J. Craig Venter
- Marcel Margulies
İlgili konular
Temel eserler
- sanger-1977
- margulies-2005
- goodwin-2016
Sıkça sorulan sorular
- Yeni nesil dizileme, Sanger dizilemesinden nasıl farklılık göstermektedir?
- Sanger dizilemesi, zincir sonlandırma kimyasını kullanarak her seferinde bir DNA fragmanını okurken, yeni nesil dizileme milyonlarca fragmanı yüksek paralel bir şekilde eş zamanlı olarak okumakta, bu da verimi büyük ölçüde artırmakta ve baz başına maliyeti düşürmektedir.
- RNA doğrudan dizilenebilmekte midir?
- RNA genellikle önce ters transkripsiyon yoluyla tamamlayıcı DNA'ya dönüştürülmekte ve ardından dizilenmektedir; bu RNA-Seq yaklaşımı transkriptleri nicelendirmekte ve ekleme (splicing) ile ekspresyon paternlerini ortaya koymaktadır.