PCR ve Nükleik Asit Amplifikasyonu
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) — döngüsel, primer yönlendirmeli, seçilen bir DNA segmentini üstel olarak kopyalayan bir yöntemdir — ve bu yöntem üzerine inşa edilen daha geniş amplifikasyon teknikleri ailesi.
Tanım
Polimeraz zincir reaksiyonu, iplik ayrılması, kenar primerlerinin bağlanması ve termostabil bir DNA polimerazı tarafından uzama döngülerinin tekrarlanmasıyla tanımlanmış bir DNA bölgesini üstel olarak amplifiye eden bir in vitro yöntemdir; nükleik asit amplifikasyonu daha geniş anlamda DNA veya RNA dizilerini kopyalamaya yönelik ilgili teknikleri kapsamaktadır.
Kapsam
Bu konu, nükleik asit amplifikasyonunun prensiplerini ve varyantlarını kapsamaktadır: polimeraz zincir reaksiyonunu tanımlayan denatürasyon, primer bağlanması ve uzama termal döngüsü; primerlerin ve termostabil polimerazın rolü; ve ters transkripsiyon ile kantitatif gerçek zamanlı amplifikasyon gibi uzantıları. Yöntemi ve mantığını ele almaktadır; amplifiye edilmiş DNA kullanan dizileme ve klonlama, ilgili diğer konularda incelenmektedir.
Temel sorular
- Tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngüleri belirli bir DNA bölgesini nasıl amplifiye eder?
- Neden iki primer ve termostabil bir polimeraz esastır?
- Amplifikasyon nasıl üstel hale gelir?
- Nükleik asitleri kantifiye etmek veya RNA'yı amplifiye etmek için yöntem nasıl genişletilir?
Temel kuramlar
- Primer Tanımlı Üstel Amplifikasyon
- Hedefi çevreleyen bir çift primer, amplifiye edilen bölgeyi tanımlar ve her yeni iplik bir sonraki döngüde kalıp görevi gördüğü için, hedef kopyalarının sayısı döngü başına yaklaşık olarak iki katına çıkarak üstel olarak artmaktadır.
- Termostabil Polimeraz Döngüyü Mümkün Kılar
- Isıya dayanıklı bir DNA polimerazı kullanmak, enzimi tekrar eklemeye gerek kalmadan tekrarlanan yüksek sıcaklık denatürasyonuna olanak tanır, bu da otomatik termal döngüyü pratik ve reaksiyonu sağlam hale getirir.
Mekanizmalar
Her döngüde, DNA ipliklerini ayırmak için örnek ısıtılır, iki primeri hedefi zıt iplikler üzerinde çevreleyen dizilere bağlamak için soğutulur ve termostabil bir polimerazın primerlerden yeni iplikler sentezlediği bir uzama sıcaklığına kadar ısıtılır. Bir döngünün ürünleri bir sonrakine kalıp görevi gördüğü için, hedef bölge birçok döngü boyunca üstel olarak amplifiye edilmektedir. Varyantları arasında, RNA'yı önce DNA'ya kopyalayan ters transkripsiyon amplifikasyonu ve başlangıç miktarlarını ölçmek için ürün birikimini izleyen gerçek zamanlı kantitatif amplifikasyon bulunmaktadır.
Klinik önem
Amplifikasyon, genetik testler, patojen tespiti ve adli kimliklendirme için merkezi bir öneme sahiptir; klinik rehberlikten ziyade önem olarak sunulmaktadır.
Tarihçe
Mullis, polimeraz zincir reaksiyonunu 1980'lerin başında tasarlamıştır ve Saiki ve arkadaşlarının 1985 tarihli raporu, termostabil polimerazın daha sonra benimsenmesiyle rutin hale gelen kullanımını göstermiştir; bu buluş, 1993 Nobel Kimya Ödülü ile tanınmıştır.
Öne çıkan isimler
- Kary Mullis
- Randall Saiki
- Henry Erlich
İlgili konular
Temel eserler
- saiki1985
- lodish2016
Sıkça sorulan sorular
- PCR neden primerlere ihtiyaç duyar?
- Primerler, her bir iplikteki sentezin başlangıç noktalarını tanımlar, böylece hangi bölgenin kopyalanacağını belirler ve polimerazın uzamayı başlatmasını sağlar.
- Amplifikasyonu üstel yapan nedir?
- Her döngünün yeni iplikleri bir sonraki döngüde kalıp haline gelir, bu nedenle hedefin kopya sayısı her döngüde yaklaşık olarak iki katına çıkar.