Moleküler Tanı: PCR, RT-PCR ve Nükleik Asit Amplifikasyonu
Moleküler tanı, bir virüsü nükleik asidini amplifiye ederek ve tanımlayarak saptamaktadır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve RNA virüsleri için ters transkripsiyon PCR (RT-PCR), hedef bir genom dizisini milyonlarca kez kopyalayarak çok küçük miktarlardaki viral genomun bile saptanabilir hale gelmesini sağlamaktadır; bu da bu yöntemlere yüksek hassasiyet ve özgüllük kazandırmakta ve onları modern viral tanının temel dayanağı haline getirmektedir.
Tanım
Moleküler tanı, PCR, RT-PCR ve izotermal yöntemler gibi amplifikasyon teknikleri aracılığıyla viral nükleik asidin saptanması ve gerektiğinde kantifikasyonudur; bu teknikler, belirli bir genom hedefini saptanabilir seviyelere kadar kopyalamaktadır.
Kapsam
Bu konu, virolojide kullanılan nükleik asit amplifikasyon tekniklerini kapsamaktadır: geleneksel ve gerçek zamanlı PCR, RNA virüsleri için ters transkripsiyon PCR, viral yükün kantitatif ölçümü ve döngü aracılı amplifikasyon gibi izotermal alternatifler. Referans düzeyinde prensipleri ve yorumlamayı açıklamaktadır ve test protokolleri veya klinik yönetim tavsiyeleri sunmamaktadır.
Temel sorular
- Bir hedef diziyi amplifiye etmek, çok küçük bir başlangıç miktarından bir virüsü nasıl saptanabilir hale getirmektedir?
- Bir RNA virüsü, bir DNA virüsüne kıyasla hangi ek adımı gerektirmektedir?
- Gerçek zamanlı PCR, viral yükü kantifiye etmek için nasıl kullanılmaktadır ve döngü eşiği ne anlama gelmektedir?
- İzotermal veya multipleks formatlar, geleneksel PCR'a ne zaman tercih edilmektedir?
Anahtar kavramlar
- Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
- Ters transkripsiyon (RT-PCR)
- Primerler ve hedef özgüllüğü
- Termal döngü ve üstel amplifikasyon
- Gerçek zamanlı (kantitatif) PCR
- Döngü eşiği ve viral yük
- Multipleks amplifikasyon
- İzotermal amplifikasyon (örn. LAMP)
Mekanizmalar
PCR, viral genomun seçilen bir bölgesini çevreleyen iki kısa primer, termostabil bir DNA polimeraz ve tekrarlayan ısıtma ve soğutma döngüleri kullanmaktadır. Her döngü DNA'yı denatüre etmekte, primerleri bağlamakta ve yeni zincirleri uzatarak hedefi iki katına çıkarmakta, böylece hedef üstel olarak birikmektedir. RNA virüsleri için, amplifikasyondan önce bir ters transkripsiyon adımı RNA genomunu tamamlayıcı DNA'ya dönüştürmektedir. Gerçek zamanlı PCR, floresan raportörler kullanarak ürün birikimini döngü döngü izlemekte ve kantifikasyona olanak tanımaktadır: sinyalin arka planın üzerine çıktığı döngü eşiği, başlangıçtaki kalıp miktarıyla ters orantılı olup, viral yükün bir tahminini vermektedir. Multipleks tasarımlar aynı anda birden fazla hedefi amplifiye etmekte ve döngü aracılı amplifikasyon gibi izotermal yöntemler sabit bir sıcaklıkta amplifikasyon sağlamakta, bu da merkezi olmayan testler için cihaz gereksinimlerini azaltmaktadır.
Klinik önem
Nükleik asit amplifikasyonu, aktif viral enfeksiyonun hassas ve özgül saptanmasını sağlamakta ve enfeksiyonların ve tedavi yanıtının takibinde kullanılan viral yük izlemesini desteklemektedir. Bu madde, yöntemlerin nasıl çalıştığını ve döngü eşiği gibi sonuçların prensipte nasıl yorumlandığını açıklamaktadır; buna, genom saptamasının tek başına enfeksiyöz virüsün varlığını kanıtlamadığı noktası da dahildir; bu, metodolojinin tanımlayıcı bir açıklaması olup, bireysel tanı veya tedavi kararları için bir temel oluşturmamaktadır.
Epidemiyoloji
Gerçek zamanlı RT-PCR, SARS-CoV-2 enfeksiyonunu doğrulamak için referans yöntem haline gelmiş ve 2020'nin başlarında valide edilmiş testlerin hızla yayımlanması, moleküler testlerin küresel ölçekte yaygınlaşmasını sağlamıştır; bu da nükleik asit amplifikasyonunun salgın tespiti ve sürveyansının temelini nasıl oluşturduğunu göstermektedir.
Tarihçe
Polimeraz zincir reaksiyonu Kary Mullis tarafından tasarlanmış ve ilk olarak 1985 yılında Saiki ve arkadaşları tarafından genetik tanıya uygulanmış, yöntem 1987 yılında Mullis ve Faloona tarafından resmileştirilmiştir. 1996 yılında Heid ve arkadaşları tarafından tanımlanan gerçek zamanlı kantitatif PCR, sürekli kantifikasyon eklemiş ve 2000 yılında Notomi ve arkadaşları tarafından tanıtılan döngü aracılı amplifikasyon gibi izotermal yöntemler, amplifikasyonun yapılabileceği yerleri genişletmiştir.
Öne çıkan isimler
- Kary Mullis
- Randall Saiki
- Christian Drosten
İlgili konular
Temel eserler
- saiki-1985
- mullis-faloona-1987
- heid-1996
- corman-2020
Sıkça sorulan sorular
- PCR ve RT-PCR arasındaki fark nedir?
- PCR, DNA'yı amplifiye etmektedir, bu nedenle doğrudan DNA virüsleri için kullanılmaktadır. RT-PCR, bir virüsün RNA genomunu önce tamamlayıcı DNA'ya dönüştüren bir ters transkripsiyon adımı eklemekte, bu da influenza ve koronavirüsler gibi RNA virüslerinin saptanmasına olanak tanımaktadır.
- Pozitif bir PCR sonucu, enfeksiyöz virüsün mevcut olduğu anlamına mı gelmektedir?
- Mutlaka değil. PCR, bir virüsün çoğalmayı veya enfeksiyöz olmayı bıraktıktan sonra bile kalabilen viral genomu saptamaktadır. Enfeksiyöz virüsün varlığını belirlemek, kültür veya klinik bağlamda yorumlanan diğer fonksiyonel testler gerektirmektedir.