Moleküler Tanı Teknikleri
Moleküler tanı teknikleri, parazitleri nükleik asitlerini çoğaltarak ve tanımlayarak tespit etmektedir; bu yöntemler, mikroskopi ve serolojinin gözden kaçırabileceği türleri, genotipleri ve karışık enfeksiyonları ayırt etme yeteneği ile yüksek analitik hassasiyet sunmaktadır. Parazitolojide bu yöntemler, geleneksel ve gerçek zamanlı PCR'dan, kaynakları kısıtlı ortamlarda hasta başı kullanımı için tasarlanmış izotermal amplifikasyon formatlarına kadar çeşitlilik göstermektedir.
Tanım
Parazitolojide moleküler tanı teknikleri, enfeksiyonu doğrulamak, türleri tiplemek ve düşük yoğunluklu veya karışık enfeksiyonları tespit etmek için PCR ve ilgili amplifikasyon kimyalarını kullanarak, parazite özgü nükleik asit dizilerini çoğaltarak ve tanımlayarak parazitleri tespit eden ve karakterize eden laboratuvar yöntemleridir.
Kapsam
Bu konu, parazitolojide nükleik asit tabanlı tespiti kapsamaktadır: polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve bunun gerçek zamanlı ve nested varyantları, loop-mediated izotermal amplifikasyon (LAMP) gibi izotermal yöntemler ve bu araçların tür tiplemesi, düşük yoğunluklu tespit ve karışık veya kriptik enfeksiyonların tanımlanması için kullanımı ele alınmaktadır. Moleküler tespiti bir tanı metodolojisi olarak ele almakta olup, klinik test veya tedavi protokolleri sunmamaktadır. Bakteriyoloji kapsamında moleküler tanılar için ilgili düğüme bakınız.
Temel sorular
- Nükleik asit amplifikasyonu, mikroskopi ve antijen testlerinin ötesinde hassasiyeti nasıl sağlamaktadır?
- Tür ve genotip tiplemesi, tanısal veya epidemiyolojik sonucu ne zaman değiştirmektedir?
- LAMP gibi izotermal yöntemleri hasta başı ve saha kullanımı için uygun kılan nedir?
- Parazit DNA'sının tespiti, canlı, aktif enfeksiyonla ilişkili olarak nasıl yorumlanmalıdır?
Anahtar kavramlar
- Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
- Nested ve gerçek zamanlı (kantitatif) PCR
- Loop-mediated izotermal amplifikasyon (LAMP)
- Tür ve genotip tiplemesi
- Karışık ve düşük yoğunluklu enfeksiyonların tespiti
- Analitik hassasiyet ve özgüllük
- DNA tespiti ve organizma canlılığı
Mekanizmalar
Bu yöntemler, parazit DNA'sının diziye özgü tanınmasını kullanmaktadır. PCR'da, termostabil polimeraz ve hedef diziyi çevreleyen primerler, denatürasyon, tavlama ve uzama döngülerinin tekrarı yoluyla üstel amplifikasyonu sağlamaktadır, böylece çok az sayıda başlangıç kopyası bile tespit edilebilmektedir; nested PCR, hassasiyet ve özgüllüğü artırmak için ikinci bir primer çifti eklemekte ve gerçek zamanlı PCR, amplifikasyonu ilerledikçe nicelendirmektedir. LAMP gibi izotermal yöntemler, birden fazla primer ve iplikçik yer değiştiren bir polimeraz kullanarak tek bir sıcaklıkta amplifikasyon sağlamaktadır, bu da termal döngü ihtiyacını ortadan kaldırmakta ve daha basit, sahada konuşlandırılabilir formatlara olanak tanımaktadır. Amplifikasyon, canlı bir organizma yerine nükleik asidi hedeflediği için, pozitif bir sonuç, parazit canlılığını yitirdikten sonra bile kalıntı DNA'nın devam edebileceği uyarısıyla yorumlanmalıdır.
Klinik önem
Moleküler teknikler, düşük yoğunluklu ve karışık enfeksiyonların tespitini iyileştirmekte ve sürveyansı ve vaka karakterizasyonunu yönlendiren tür ve genotip tanımlamasını sağlamaktadır. Bu madde, yöntemleri ve kanıt olarak yorumlama sınırlarını açıklamaktadır ve laboratuvar protokollerinin veya klinik karar verme süreçlerinin yerine geçmemektedir.
Epidemiyoloji
Mikroskobik eşiğin altındaki enfeksiyonları tespit ederek ve tür karışımlarını çözerek, moleküler yöntemler sıtma ve diğer enfeksiyonlardaki submikroskobik parazit taşıyıcılığı tahminlerini revize etmiş, bulaşma modellerini ve kontrol programı değerlendirmesini bilgilendirmektedir; izotermal formatlar, endemik, kaynakları kısıtlı ortamlarda merkezi olmayan testler için giderek daha fazla araştırılmaktadır.
Tarihçe
Saiki ve arkadaşları tarafından 1988'de termostabil polimeraz PCR'ın tanıtılması, rutin nükleik asit amplifikasyonunu pratik hale getirmiş ve kısa süre sonra parazitler için uyarlanmıştır; 1990'ların başında nested-PCR testleri sıtma tespitinin hassasiyetini önemli ölçüde artırmıştır. 2000 yılında loop-mediated izotermal amplifikasyonun tanımlanması, paraziter hastalıklar için geliştirilmeye devam eden, ekipman gereksinimi az, hasta başı moleküler tanılara giden yolu açmıştır.
Tartışmalar
- Parazit DNA'sını tespit etmek aktif enfeksiyonu kanıtlar mı?
- Amplifikasyon, parazit nükleik asidinin varlığını doğrulamaktadır ancak tek başına canlı bir organizmanın bulunduğunu kanıtlayamamaktadır, çünkü temizlendikten sonra kalıntı DNA devam edebilmektedir; bu durum, moleküler pozitifliğin bir tedavi testi olarak kullanımını karmaşıklaştırmaktadır.
İlgili konular
Temel eserler
- saiki-1988
- notomi-2000
- snounou-1993
Sıkça sorulan sorular
- Moleküler testler neden genellikle mikroskopiden daha hassastır?
- Amplifikasyon, parazit DNA'sının az sayıdaki kopyasını tespit edilebilir bir sinyale dönüştürebilmektedir, bu nedenle mikroskopinin gözden kaçıracağı çok düşük parazit yoğunluğuna sahip enfeksiyonlar bile tespit edilebilmekte ve tür düzeyinde tanımlanabilmektedir.
- LAMP'ın geleneksel PCR'a göre ne gibi bir avantajı vardır?
- LAMP, DNA'yı termal döngü cihazı olmadan tek bir sabit sıcaklıkta çoğaltmaktadır, bu da onu daha basit, daha hızlı ve hasta başı ve saha koşulları için daha uygun hale getirmektedir, ancak test tasarımı ve yorumlaması yine de dikkat gerektirmektedir.