ดีเอ็นเอลูกผสมและการโคลนระดับโมเลกุล

เอนไซม์ตัดจำเพาะ, ไลเกส, และเวกเตอร์ถูกนำมาใช้ในการตัดและเชื่อมต่อดีเอ็นเอจากแหล่งที่มาต่างกัน และเพิ่มจำนวนในเซลล์เจ้าบ้านได้อย่างไร — ซึ่งเป็นเทคโนโลยีพื้นฐานของพันธุวิศวกรรม

Definition

ดีเอ็นเอลูกผสมและการโคลนระดับโมเลกุลคือชุดของวิธีการสำหรับการเชื่อมต่อชิ้นส่วนดีเอ็นเอจากแหล่งที่มาต่างกันเข้ากับเวกเตอร์ และเพิ่มจำนวนโมเลกุลที่ได้ในเซลล์เจ้าบ้าน เพื่อให้ลำดับดีเอ็นเอที่เลือกสามารถเพิ่มจำนวน, บำรุงรักษา, และศึกษาได้

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมการสร้างดีเอ็นเอลูกผสมและการโคลน: เอนไซม์ตัดจำเพาะและการตัดดีเอ็นเอที่ตำแหน่งจำเพาะ, การเชื่อมต่อชิ้นส่วนด้วยดีเอ็นเอไลเกส, การใช้พลาสมิดและเวกเตอร์อื่น ๆ, การนำเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน, และการคัดเลือกดีเอ็นเอลูกผสม หัวข้อนี้จะกล่าวถึงหลักการของการโคลน; ส่วนการเพิ่มจำนวน, การหาลำดับ, และการตัดต่อในขั้นตอนถัดไปจะครอบคลุมในหัวข้อที่เกี่ยวข้อง

Core questions

• เอนไซม์ตัดจำเพาะตัดดีเอ็นเอที่ลำดับจำเพาะได้อย่างไร?
• ชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกเชื่อมต่อเข้ากับเวกเตอร์ได้อย่างไร?
• เวกเตอร์คืออะไร และนำดีเอ็นเอแปลกปลอมเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านได้อย่างไร?
• เซลล์ที่มียีนลูกผสมที่ต้องการถูกคัดเลือกได้อย่างไร?

Key theories

การตัดและการเชื่อมต่อที่จำเพาะต่อลำดับ

เอนไซม์ตัดจำเพาะจดจำและตัดลำดับดีเอ็นเอที่กำหนดไว้ ซึ่งมักจะทิ้งปลายที่เข้าคู่กัน ซึ่งดีเอ็นเอไลเกสสามารถเชื่อมต่อได้ ทำให้ชิ้นส่วนจากแหล่งที่มาต่างกันสามารถรวมกันใหม่ได้อย่างคาดการณ์ได้

การเพิ่มจำนวนโดยเวกเตอร์

การแทรกชิ้นส่วนเข้าไปในเวกเตอร์ที่จำลองตัวเองได้ และนำเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน ทำให้ดีเอ็นเอลูกผสมถูกคัดลอกไปพร้อมกับเซลล์เจ้าบ้าน ทำให้ได้โคลนของลำดับที่เลือกจำนวนมาก

Mechanisms

เอนไซม์ตัดจำเพาะจะตัดทั้งดีเอ็นเอเป้าหมายและเวกเตอร์ที่ตำแหน่งจดจำจำเพาะ ซึ่งมักจะสร้างปลายสายเดี่ยวที่เข้าคู่กัน ชิ้นส่วนต่าง ๆ จะถูกผสมและเชื่อมต่อกันด้วยดีเอ็นเอไลเกสเพื่อสร้างโมเลกุลลูกผสม ซึ่งจะถูกนำเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านโดยการเปลี่ยนแปลงสภาพ (transformation) หรือวิธีการที่เกี่ยวข้อง เนื่องจากเวกเตอร์มีจุดเริ่มต้นของการจำลองตัวเอง (origin of replication) และเครื่องหมายคัดเลือก (selectable markers) เซลล์เจ้าบ้านที่รับและรักษาสภาพดีเอ็นเอลูกผสมไว้ได้จึงสามารถถูกระบุและเพาะเลี้ยงได้ ทำให้เกิดการผลิตลำดับที่ถูกโคลนในปริมาณมากเพื่อนำไปใช้ประโยชน์ต่อไป

Clinical relevance

การโคลนระดับโมเลกุลเป็นพื้นฐานของการผลิตโปรตีนลูกผสม เช่น อินซูลินและแอนติบอดี และการสร้างเวกเตอร์สำหรับการบำบัดด้วยยีนและวัคซีน; นำเสนอในฐานะความสำคัญ ไม่ใช่คำแนะนำทางคลินิก

History

การระบุลักษณะของเอนไซม์ตัดจำเพาะโดย Arber, Smith, และ Nathans และการสร้างโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมชุดแรกโดย Berg, Cohen, และ Boyer ในช่วงต้นทศวรรษ 1970 ได้ก่อตั้งการโคลนระดับโมเลกุลและได้รับการยอมรับจากรางวัลโนเบล ทำให้พันธุวิศวกรรมกลายเป็นเรื่องปกติ

Key figures

• Hamilton Smith
• Daniel Nathans
• Werner Arber
• Paul Berg
• Herbert Boyer
• Stanley Cohen

Seminal works

• smith1970
• watson2013

Frequently asked questions

เอนไซม์ตัดจำเพาะทำหน้าที่อะไร?

มันจดจำลำดับดีเอ็นเอสั้นๆ ที่จำเพาะและตัดดีเอ็นเอที่ตำแหน่งนั้น ซึ่งมักจะทิ้งปลายที่สามารถเชื่อมต่อกับชิ้นส่วนอื่นที่ถูกตัดด้วยเอนไซม์เดียวกันได้

ทำไมจึงจำเป็นต้องมีเวกเตอร์ในการโคลน?

เวกเตอร์นำดีเอ็นเอที่แทรกเข้าไปในเซลล์เจ้าบ้านและจำลองตัวเองที่นั่น ดังนั้นลำดับที่ถูกโคลนจึงถูกคัดลอกและสามารถถูกคัดเลือกและเพิ่มจำนวนได้