ดีเอ็นเอลูกผสมและเทคนิคที่เกี่ยวข้อง
ชุดเครื่องมือที่ช่วยให้นักชีววิทยาระดับโมเลกุลสามารถตัด, เชื่อมต่อ, คัดลอก, อ่าน และแก้ไขดีเอ็นเอได้ ซึ่งเป็นวิธีการที่เปลี่ยนความเข้าใจระดับโมเลกุลของยีนให้กลายเป็นพลังในการทดลองและวิศวกรรม
Definition
ดีเอ็นเอลูกผสมและเทคนิคที่เกี่ยวข้องคือชุดของวิธีการสำหรับการจัดการกรดนิวคลีอิกในหลอดทดลองและในเซลล์ — การเชื่อมต่อดีเอ็นเอจากแหล่งที่มาต่างกัน, การขยายพันธุ์, การเพิ่มปริมาณและการหาลำดับ, และการแก้ไขจีโนมในตำแหน่งที่เลือก — ซึ่งเป็นรากฐานของชีววิทยาระดับโมเลกุลและเทคโนโลยีชีวภาพสมัยใหม่
Scope
สาขานี้ครอบคลุมวิธีการทดลองหลักของชีววิทยาระดับโมเลกุล: การสร้างดีเอ็นเอลูกผสมและการโคลนโดยใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะและเวกเตอร์, การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยปฏิกิริยาโพลีเมอเรสเชน, การหาลำดับนิวคลีโอไทด์ และการแก้ไขจีโนมแบบจำเพาะเจาะจง โดยจะกล่าวถึงหลักการและตรรกะของแต่ละเทคนิค; การประยุกต์ใช้เฉพาะทางมากมายในชีววิทยาและการแพทย์จะถูกบันทึกไว้เป็นความสำคัญ
Sub-topics
Core questions
- ดีเอ็นเอจากแหล่งที่มาต่างกันถูกตัดและเชื่อมต่อกันเพื่อสร้างโมเลกุลลูกผสมได้อย่างไร?
- ลำดับดีเอ็นเอที่จำเพาะสามารถถูกคัดลอกได้หลายล้านครั้งได้อย่างไร?
- ลำดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอถูกกำหนดได้อย่างไร?
- จีโนมสามารถถูกแก้ไขในตำแหน่งที่เลือกได้อย่างไร?
Key theories
- การรวมตัวกันใหม่โดยใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะ
- เอนไซม์ตัดจำเพาะจะตัดดีเอ็นเอในลำดับที่กำหนด และชิ้นส่วนที่ได้สามารถถูกเชื่อมต่อเข้ากับเวกเตอร์ด้วยการไลเกชัน ซึ่งเป็นวิธีการพื้นฐานสำหรับการสร้างและขยายพันธุ์ดีเอ็นเอลูกผสม
- การเพิ่มปริมาณในหลอดทดลอง
- ปฏิกิริยาโพลีเมอเรสเชนใช้ไพรเมอร์และโพลีเมอเรสที่ทนความร้อนผ่านการให้ความร้อนและทำให้เย็นซ้ำๆ เพื่อเพิ่มปริมาณส่วนของดีเอ็นเอที่เลือกแบบทวีคูณ ทำให้สามารถวิเคราะห์ลำดับในปริมาณน้อยมากได้
Mechanisms
ดีเอ็นเอลูกผสมถูกสร้างขึ้นโดยการตัดดีเอ็นเอต้นกำเนิดและเวกเตอร์ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะและเชื่อมต่อเข้าด้วยกันด้วยไลเกส จากนั้นนำโครงสร้างที่ได้เข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านที่ทำการจำลองแบบ ดีเอ็นเอลูกผสม ปฏิกิริยาโพลีเมอเรสเชนจะเพิ่มปริมาณบริเวณที่กำหนดโดยการวนรอบระหว่างการแยกสายดีเอ็นเอ, การจับของไพรเมอร์ และการสังเคราะห์โดยโพลีเมอเรสที่ทนความร้อน การหาลำดับจะอ่านลำดับของเบส โดยทั่วไปจะใช้วิธีการสังเคราะห์แบบหยุดสาย และปัจจุบันส่วนใหญ่ใช้วิธีการแบบขนานจำนวนมาก การแก้ไขจีโนมใช้เอนไซม์นิวคลีเอสที่สามารถตั้งโปรแกรมได้ โดยเฉพาะระบบ CRISPR–Cas เพื่อสร้างรอยแตกในตำแหน่งที่เลือกซึ่งเซลล์จะซ่อมแซม ทำให้สามารถเปลี่ยนแปลงได้อย่างแม่นยำ
Clinical relevance
เทคนิคเหล่านี้เป็นรากฐานของการวินิจฉัยทางพันธุกรรม, การผลิตยาชีววัตถุและวัคซีน, และการบำบัดด้วยยีนและเซลล์; นำเสนอในฐานะความสำคัญมากกว่าคำแนะนำทางคลินิก
History
การค้นพบเอนไซม์ตัดจำเพาะที่จำเพาะต่อลำดับและการสร้างโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมครั้งแรกในช่วงต้นทศวรรษ 1970 ได้เปิดตัววิศวกรรมพันธุกรรม; ปฏิกิริยาโพลีเมอเรสเชน, การหาลำดับอย่างรวดเร็ว และล่าสุด การแก้ไขด้วย CRISPR ได้ขยายชุดเครื่องมือระดับโมเลกุลที่ได้รับการยอมรับจากรางวัลโนเบลหลายรางวัลอย่างต่อเนื่อง
Key figures
- Hamilton Smith
- Paul Berg
- Kary Mullis
- Frederick Sanger
- Jennifer Doudna
- Emmanuelle Charpentier
Related topics
Seminal works
- smith1970
- saiki1985
- watson2013
Frequently asked questions
- ดีเอ็นเอลูกผสมคืออะไร?
- โมเลกุลดีเอ็นเอที่ประกอบขึ้นในห้องปฏิบัติการจากชิ้นส่วนที่มีต้นกำเนิดต่างกัน โดยทั่วไปโดยการตัดและเชื่อมต่อดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์ จากนั้นนำไปขยายพันธุ์ในเซลล์เจ้าบ้าน
- ทำไมปฏิกิริยาโพลีเมอเรสเชนจึงมีความสำคัญมาก?
- ช่วยให้นักวิจัยสามารถคัดลอกลำดับดีเอ็นเอที่จำเพาะแบบทวีคูณจากตัวอย่างขนาดเล็ก ทำให้การตรวจจับ การหาลำดับ และการโคลนรวดเร็วและมีความไวมากขึ้นมาก