การจัดลำดับจีโนมทั้งหมด

การจัดลำดับจีโนมทั้งหมด (Whole-genome sequencing หรือ WGS) เป็นการระบุลำดับนิวคลีโอไทด์เกือบทั้งหมดของจีโนมของสิ่งมีชีวิตในการทดสอบครั้งเดียว แทนที่จะกำหนดเป้าหมายยีนหรือบริเวณที่เลือกไว้ ด้วยการอ่านทั้งดีเอ็นเอส่วนที่เข้ารหัสและไม่เข้ารหัส ทำให้ได้ชุดข้อมูลจีโนมหลักที่ครอบคลุมมากที่สุด และใช้เป็นข้อมูลนำเข้าสำหรับการประกอบ (assembly) การระบุความแปรผัน (variant calling) และการวิเคราะห์จีโนมขั้นปลาย

Definition

การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดเป็นกระบวนการทางห้องปฏิบัติการและการคำนวณเพื่อกำหนดลำดับของนิวคลีโอไทด์ทั้งหมดในจีโนมของสิ่งมีชีวิต โดยทั่วไปจะทำโดยการแยกส่วนดีเอ็นเอ การอ่านส่วนที่แยกได้ด้วยความครอบคลุมที่ซ้ำซ้อน และการประกอบหรือการจัดเรียงเพื่อกู้คืนลำดับทั้งหมด

Scope

เนื้อหานี้ครอบคลุมถึงสิ่งที่ WGS วัดได้ กลยุทธ์แบบช็อตกัน (shotgun strategy) ในการแยกส่วนและอ่านจีโนมด้วยความครอบคลุมสูง ความแตกต่างจากการเข้าถึงแบบกำหนดเป้าหมาย เช่น การจัดลำดับเอ็กโซมทั้งหมด และบทบาทของความลึกของการจัดลำดับในการกำหนดความไว หัวข้อนี้เป็นเรื่องเกี่ยวกับระเบียบวิธีวิจัยและไม่ได้ให้คำแนะนำทางคลินิกหรือการทดสอบใดๆ

Core questions

• การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดสามารถตรวจจับอะไรได้บ้างที่การจัดลำดับแบบกำหนดเป้าหมายไม่สามารถทำได้?
• กลยุทธ์แบบช็อตกันสร้างจีโนมทั้งหมดขึ้นมาใหม่จากส่วนสั้นๆ จำนวนมากได้อย่างไร?
• ความลึกของการจัดลำดับส่งผลต่อการตรวจจับความแปรผันได้อย่างไร?

Key concepts

• การจัดลำดับแบบช็อตกัน
• ความลึกและความครอบคลุมของการจัดลำดับ
• การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดเทียบกับการจัดลำดับเอ็กโซมทั้งหมด
• บริเวณที่เข้ารหัสและไม่เข้ารหัส
• เคมีแบบ reversible terminator
• ข้อมูลนำเข้าสำหรับการระบุความแปรผัน

Mechanisms

ในการจัดลำดับจีโนมทั้งหมด ดีเอ็นเอจีโนมจะถูกแยกส่วนและอ่านซ้ำหลายครั้ง เพื่อให้แต่ละตำแหน่งถูกครอบคลุมด้วยการอ่านอิสระหลายครั้ง ความซ้ำซ้อน (ความลึก) ช่วยให้สามารถตรวจสอบการระบุเบสและสนับสนุนการตรวจจับความแปรผันได้ วิธีการแบบช็อตกันของจีโนมทั้งหมด ซึ่งแสดงให้เห็นในระดับมนุษย์โดย Venter และคณะ ได้แบ่งจีโนมออกเป็นส่วนสุ่ม จัดลำดับ และประกอบใหม่ด้วยคอมพิวเตอร์ ต่อมาเคมีแบบ reversible-terminator ทำให้สามารถอ่านจีโนมมนุษย์ทั้งหมดแบบขนานจำนวนมากได้อย่างแม่นยำด้วยต้นทุนที่ต่ำลงมาก เนื่องจากการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดอ่านดีเอ็นเอทั้งส่วนที่ไม่เข้ารหัสและส่วนที่เข้ารหัส จึงสามารถตรวจจับความแปรผันด้านการควบคุมและโครงสร้างที่การทดสอบแบบกำหนดเป้าหมายพลาดไปได้

Clinical relevance

การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดมีการใช้เพิ่มขึ้นในการวิจัยและจีโนมิกส์ทางคลินิกเพื่อระบุลักษณะทางพันธุกรรมที่สมบูรณ์ของแต่ละบุคคล ซึ่งสนับสนุนการค้นพบความแปรผันในบริเวณที่เข้ารหัสและไม่เข้ารหัส เนื้อหานี้อธิบายวิธีการและลักษณะข้อมูล เป็นเอกสารอ้างอิงเพื่อการศึกษาและไม่ใช่คำแนะนำสำหรับการทดสอบหรือการดำเนินการทางคลินิกใดๆ

Evidence & guidelines

หลักฐานพื้นฐานคือชุดของการศึกษาหลักที่สำคัญ: ลำดับจีโนมมนุษย์สองชุดที่ตีพิมพ์ในปี 2001 (Venter et al.; International Human Genome Sequencing Consortium) และการแสดงให้เห็นถึงการจัดลำดับจีโนมทั้งหมดแบบขนานจำนวนมากที่แม่นยำโดย Bentley et al. (2008) การทบทวนระเบียบวิธีวิจัย เช่น Sims et al. (2014) ได้บันทึกว่าความลึกและความครอบคลุมมีผลต่อความไวในการวิเคราะห์อย่างไร

History

การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดในระดับมนุษย์ประสบความสำเร็จครั้งแรกในปี 2001 ผ่านความพยายามสองทางที่ขนานกัน โดยวิธีหนึ่งใช้การจัดลำดับแบบโคลนตามลำดับชั้น และอีกวิธีหนึ่งใช้การประกอบแบบช็อตกันของจีโนมทั้งหมด การแสดงให้เห็นถึงการจัดลำดับที่แม่นยำด้วยเคมีแบบ reversible-terminator ในปี 2008 ทำให้การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดในระดับประชากรเป็นไปได้ และความลึกและความครอบคลุมกลายเป็นพารามิเตอร์การออกแบบที่สำคัญเมื่อวิธีการพัฒนาขึ้น

Key figures

• J. Craig Venter
• Eric Lander
• David Bentley

Seminal works

• venter-2001
• ihgsc-2001-wgs
• bentley-2008

Frequently asked questions

การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดแตกต่างจากการจัดลำดับเอ็กโซมทั้งหมดอย่างไร?

การจัดลำดับจีโนมทั้งหมดจะอ่านจีโนมทั้งหมดโดยพื้นฐาน รวมถึงบริเวณที่ไม่เข้ารหัสและบริเวณควบคุม ในขณะที่การจัดลำดับเอ็กโซมทั้งหมดจะกำหนดเป้าหมายเฉพาะส่วนที่เข้ารหัสโปรตีน (เอ็กโซม) ซึ่งเป็นส่วนเล็กๆ ของจีโนมเท่านั้น

เหตุใดความลึกของการจัดลำดับจึงมีความสำคัญในการจัดลำดับจีโนมทั้งหมด?

ความลึก (จำนวนการอ่านที่ครอบคลุมแต่ละตำแหน่ง) กำหนดความมั่นใจในการระบุเบสและความแปรผันที่สามารถทำได้ ความลึกที่สูงขึ้นช่วยเพิ่มความไวและความแม่นยำ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการตรวจจับความแปรผันที่มีความถี่ต่ำหรือแบบเฮเทอโรไซกัส