อิมมูโนฮิสโตเคมีและวิธีการตรวจหาโปรตีน

อิมมูโนฮิสโตเคมี (Immunohistochemistry, IHC) เป็นวิธีการระบุตำแหน่งและวัดปริมาณโปรตีนในชิ้นเนื้อเยื่อโดยใช้แอนติบอดีที่เชื่อมโยงกับฉลากที่มองเห็นได้ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าผลิตภัณฑ์ของยีนมีการแสดงออกที่ใด และปริมาณเท่าใดในเชิงกึ่งปริมาณ (semi-quantitatively) ในฐานะที่เป็นวิธีการตรวจหาโปรตีนที่เทียบเท่ากับการหาปริมาณทรานสคริปต์ (transcript quantification) IHC จึงเป็นเครื่องมือที่ใช้เป็นประจำในการวินิจฉัยและพยาธิวิทยาโมเลกุล

Definition

อิมมูโนฮิสโตเคมีเป็นวิธีการที่ใช้เนื้อเยื่อเป็นหลัก โดยใช้แอนติบอดีที่มีฉลากเพื่อตรวจหาโปรตีนจำเพาะในแหล่งกำเนิด (in situ) ทำให้เห็นตำแหน่งของเซลล์และออร์แกเนลล์ (subcellular location) และให้ค่าประมาณเชิงกึ่งปริมาณของการแสดงออกของโปรตีน

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมหลักการตรวจหาโดยใช้แอนติบอดี ความแตกต่างระหว่างการระบุตำแหน่งเชิงคุณภาพและการให้คะแนนเชิงกึ่งปริมาณของความเข้มข้นและขอบเขตของการย้อมสี ความสำคัญของการสร้างมาตรฐานและการควบคุม และการประยุกต์ใช้ที่เป็นที่รู้จักกันดี เช่น การประเมินตัวรับฮอร์โมนและ HER2 เพื่อเป็นตัวอย่างของวิธีการ หัวข้อนี้ถือว่า IHC เป็นระเบียบวิธีในการวัด และไม่ได้ให้เกณฑ์การวินิจฉัยหรือแนวทางการรักษา

Core questions

• แอนติบอดีที่มีฉลากระบุตำแหน่งโปรตีนภายในชิ้นเนื้อเยื่อได้อย่างไร?
• การย้อมสีถูกแปลงเป็นคะแนนเชิงกึ่งปริมาณได้อย่างไร?
• เหตุใดการควบคุมและการสร้างมาตรฐานจึงจำเป็นสำหรับ IHC ที่สามารถทำซ้ำได้?
• การตรวจหาระดับโปรตีนเสริมการหาปริมาณทรานสคริปต์ได้อย่างไร?

Key concepts

• การจับกันของแอนติบอดี-แอนติเจน
• การกู้คืนแอนติเจน
• การตรวจหาด้วยโครโมเจนและฟลูออเรสเซนต์
• การให้คะแนนเชิงกึ่งปริมาณ (ความเข้มข้นและขอบเขต)
• การควบคุมเชิงบวกและเชิงลบ
• ผลกระทบของการตรึงก่อนการวิเคราะห์

Mechanisms

แอนติบอดีปฐมภูมิ (primary antibody) จะจับกับแอนติเจนเป้าหมายในชิ้นเนื้อเยื่อที่ตรึงไว้ การตรวจหาจะถูกขยายสัญญาณผ่านแอนติบอดีทุติยภูมิ (secondary antibodies) และระบบที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์หรือฟลูออโรฟอร์ (fluorophore-linked systems) ซึ่งสร้างตะกอนที่มีสีหรือเรืองแสง ณ ตำแหน่งของแอนติเจน ขั้นตอนการตรึง (fixation) และการกู้คืนแอนติเจน (antigen-retrieval) มีอิทธิพลต่อการที่เอพิโทป (epitopes) ยังคงสามารถตรวจจับได้หรือไม่ ดังนั้นการจัดการก่อนการวิเคราะห์ (pre-analytical handling) จึงส่งผลกระทบอย่างมากต่อผลลัพธ์ การแสดงออกจะถูกอ่านในเชิงกึ่งปริมาณโดยการพิจารณาความเข้มของการย้อมสีและสัดส่วนของเซลล์ที่เป็นบวก ซึ่งมักจะรวมกันเป็นคะแนน เนื่องจากผลการอ่านนี้ขึ้นอยู่กับผู้สังเกตการณ์และโปรโตคอล จึงจำเป็นต้องมีการควบคุมที่ผ่านการตรวจสอบและขั้นตอนที่เป็นมาตรฐานเพื่อความสามารถในการทำซ้ำ (reproducibility) แนวทางปฏิบัติทางวิชาชีพแสดงให้เห็นว่าการให้คะแนนและตัวแปรก่อนการวิเคราะห์ได้รับการสร้างมาตรฐานสำหรับการทดสอบตัวรับอย่างไร (Hammond et al., 2010; Wolff et al., 2013)

Clinical relevance

IHC มีความสำคัญต่อการวินิจฉัยเนื้อเยื่อและการรายงานไบโอมาร์คเกอร์โปรตีน และการทำความเข้าใจลักษณะเชิงกึ่งปริมาณของ IHC เป็นส่วนหนึ่งของการตีความรายงานทางพยาธิวิทยา บทความนี้อธิบายวิธีการและการสร้างมาตรฐาน โดยอ้างอิงแนวทางปฏิบัติที่กล่าวถึงเพื่อแสดงให้เห็นถึงระเบียบวิธีและการรายงาน ไม่ได้มีวัตถุประสงค์เพื่อให้ค่าตัด (cut-offs) ในการวินิจฉัยหรือการตัดสินใจในการรักษาสำหรับผู้ป่วยแต่ละราย

Evidence & guidelines

การสร้างมาตรฐานของ IHC เชิงกึ่งปริมาณเป็นตัวอย่างโดยแนวทางปฏิบัติร่วมของ ASCO/CAP สำหรับการทดสอบตัวรับเอสโตรเจนและโปรเจสเตอโรน (Hammond et al., 2010) และสำหรับการทดสอบ HER2 ในมะเร็งเต้านม (Wolff et al., 2013) ซึ่งกำหนดการจัดการก่อนการวิเคราะห์ การให้คะแนน และข้อกำหนดในการควบคุม สิ่งเหล่านี้ถูกอ้างถึงในที่นี้เพื่อเป็นข้อมูลอ้างอิงทางระเบียบวิธี

History

การย้อมสีเนื้อเยื่อโดยใช้แอนติบอดีพัฒนามาจากการเรืองแสงทางภูมิคุ้มกัน (immunofluorescence) ในช่วงกลางศตวรรษที่ 20 ตามมาด้วยวิธีการอิมมูโนเปอร์ออกซิเดสที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (enzyme-linked immunoperoxidase methods) ซึ่งช่วยให้เกิดการย้อมสีถาวรที่มองเห็นได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง เมื่อไบโอมาร์คเกอร์โปรตีนกลายเป็นหัวใจสำคัญของพยาธิวิทยา ความสนใจก็เปลี่ยนไปสู่การสร้างมาตรฐานการตรึง การกู้คืนแอนติเจน และการให้คะแนน ซึ่งถูกกำหนดเป็นทางการในแนวทางปฏิบัติที่เป็นเอกฉันท์สำหรับการทดสอบตัวรับ (Hammond et al., 2010; Wolff et al., 2013)

Debates

การให้คะแนน IHC เชิงกึ่งปริมาณมีความสามารถในการทำซ้ำได้มากน้อยเพียงใด?

เนื่องจากความเข้มข้นและขอบเขตของการย้อมสีถูกตัดสินด้วยสายตาและขึ้นอยู่กับการตรึงและโปรโตคอล ผลลัพธ์จึงอาจแตกต่างกันไปในแต่ละผู้สังเกตการณ์และห้องปฏิบัติการ การจัดการก่อนการวิเคราะห์ที่เป็นมาตรฐาน การควบคุมที่ผ่านการตรวจสอบ และเกณฑ์การให้คะแนนที่กำหนดไว้ถูกนำมาใช้เพื่อปรับปรุงความสามารถในการทำซ้ำ

Key figures

• M. Elizabeth Hammond
• Antonio Wolff
• D. Craig Allred

Seminal works

• hammond-2010
• wolff-2013

Frequently asked questions

อิมมูโนฮิสโตเคมีเป็นเชิงปริมาณหรือไม่?

IHC อธิบายได้ดีที่สุดว่าเป็นเชิงกึ่งปริมาณ (semi-quantitative): เป็นการประมาณการแสดงออกของโปรตีนโดยการพิจารณาความเข้มของการย้อมสีและสัดส่วนของเซลล์ที่เป็นบวก แทนที่จะให้ความเข้มข้นที่แน่นอน ซึ่งเป็นเหตุผลว่าทำไมการให้คะแนนที่เป็นมาตรฐานและการควบคุมจึงมีความสำคัญ

เหตุใดการตรึงเนื้อเยื่อจึงส่งผลต่อผลลัพธ์ IHC?

การตรึงและขั้นตอนการกู้คืนแอนติเจนที่ตามมาสามารถบดบังหรือเปิดเผยเอพิโทปที่แอนติบอดีจับได้ ดังนั้นความแปรปรวนในการจัดการก่อนการวิเคราะห์สามารถเปลี่ยนแปลงการย้อมสีได้ และต้องได้รับการสร้างมาตรฐานเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้