เทคนิคการเพาะเลี้ยงไวรัสและการเพาะเลี้ยงเซลล์

การเพาะเลี้ยงไวรัสคือการเพิ่มจำนวนไวรัสในเซลล์โฮสต์ที่มีชีวิต เพื่อให้สามารถตรวจพบการมีอยู่ของไวรัสและกู้คืนไวรัสเพื่อการศึกษาเพิ่มเติมได้ เนื่องจากไวรัสเพิ่มจำนวนได้เฉพาะภายในเซลล์ ระบบการเพาะเลี้ยง — ในอดีตคือไข่ที่มีตัวอ่อนและสัตว์ แต่ปัจจุบันส่วนใหญ่เป็นเซลล์ (เนื้อเยื่อ) เพาะเลี้ยง — จึงเป็นพื้นผิวที่ไวรัสสามารถเจริญเติบโต แสดงตัวตนผ่านการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ที่มีลักษณะเฉพาะ และถูกแยกออกมาได้

Definition

การเพาะเลี้ยงไวรัสคือการเพาะเลี้ยงไวรัสในเซลล์มีชีวิตที่ไวต่อการติดเชื้อ เพื่อให้ไวรัสสามารถเพิ่มจำนวน ตรวจจับได้ (โดยทั่วไปผ่านผลกระทบต่อเซลล์หรือการย้อมสีเฉพาะ) และแยกออกมาเพื่อระบุชนิดและศึกษาลักษณะเพิ่มเติม

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมหลักการของการเพาะเลี้ยงไวรัสในเซลล์เพาะเลี้ยง การรับรู้การเพิ่มจำนวนของไวรัสผ่านผลกระทบต่อเซลล์ (cytopathic effect) และตัวบ่งชี้ที่เกี่ยวข้อง รูปแบบที่เร่งรัด เช่น การเพาะเลี้ยงในหลอดเชลล์ (shell vial culture) และบทบาทต่อเนื่องของการเพาะเลี้ยงควบคู่ไปกับวิธีการทางโมเลกุล หัวข้อนี้ถือว่าการเพาะเลี้ยงเป็นหัวข้อทางระเบียบวิธีวิจัย และไม่ได้ให้ระเบียบปฏิบัติการในห้องปฏิบัติการหรือคำแนะนำทางคลินิก

Core questions

• ระบบเซลล์ใดที่สนับสนุนการเพิ่มจำนวนของไวรัสที่กำหนด?
• จะรับรู้การเจริญเติบโตของไวรัสและแยกแยะจากการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงได้อย่างไร?
• เมื่อใดที่การกู้คืนไวรัสที่ติดเชื้อได้จะเพิ่มคุณค่ามากกว่าการตรวจหาจีโนมหรือแอนติเจนของไวรัส?
• จะเร่งการเพาะเลี้ยงได้อย่างไรในขณะที่ยังคงรักษาข้อดีของการกู้คืนไวรัสมีชีวิตไว้ได้?

Key concepts

• ผลกระทบต่อเซลล์ (Cytopathic effect)
• เซลล์เพาะเลี้ยง (เนื้อเยื่อ) ชั้นเดียว (Cell (tissue) culture monolayer)
• เซลล์ที่ยอมให้ไวรัสเพิ่มจำนวนและเซลล์ที่ไวต่อการติดเชื้อ (Permissive and susceptible cells)
• การก่อตัวของพลาก (Plaque formation)
• การทดสอบหลอดเชลล์ (Shell vial assay)
• การดูดซับเม็ดเลือดแดง (Hemadsorption)
• การแยกเชื้อไวรัสและการถ่ายเชื้อ (Virus isolation and passage)

Mechanisms

ตัวอย่างทางคลินิกจะถูกนำไปเพาะบนเซลล์เพาะเลี้ยงชั้นเดียวที่เลือกมาเนื่องจากมีความไวต่อไวรัสที่สงสัย เมื่อไวรัสเพิ่มจำนวน มันจะเปลี่ยนแปลงเซลล์โฮสต์ ทำให้เกิดผลกระทบต่อเซลล์ — เช่น เซลล์กลมขึ้น, เซลล์แตก, การรวมตัวเป็นซินไซเทียม (syncytium formation) หรือการเกิดอินคลูชันบอดี (inclusion bodies) — ซึ่งรูปแบบของผลกระทบนี้เป็นเบาะแสในการระบุชนิดของไวรัส จากนั้นจึงยืนยันด้วยการย้อมสีหรือวิธีการทางโมเลกุล ไวรัสบางชนิดถูกตรวจพบทางอ้อม เช่น โดยการดูดซับเม็ดเลือดแดง (hemadsorption) บนเซลล์เพาะเลี้ยงที่ติดเชื้อ เทคนิคหลอดเชลล์ (shell vial technique) จะปั่นเหวี่ยงตัวอย่างลงบนเซลล์และใช้การตรวจหาแอนติเจนระยะแรกเพื่อลดระยะเวลาในการได้ผล การกู้คืนไวรัสที่ติดเชื้อได้โดยการถ่ายเชื้อ (passage) ช่วยให้สามารถศึกษาฟีโนไทป์ได้ เช่น การจำแนกลักษณะทางแอนติเจน (antigenic characterisation) และความไวต่อยาต้านไวรัส ซึ่งการตรวจหาจีโนมเพียงอย่างเดียวไม่สามารถให้ข้อมูลได้

Clinical relevance

ในอดีต การเพาะเลี้ยงเป็นรากฐานของการวินิจฉัยไวรัส และยังคงเป็นวิธีการอ้างอิงสำหรับการกู้คืนไวรัสที่ติดเชื้อได้ การสนับสนุนการจำแนกลักษณะทางฟีโนไทป์ และการยืนยันเชื้อก่อโรคชนิดใหม่หรือที่ไม่คาดคิด บทความนี้อธิบายสิ่งที่การเพาะเลี้ยงแสดงให้เห็นและข้อดีข้อเสียในด้านความเร็วและความไว; เป็นการอธิบายระเบียบวิธีวิจัยและไม่ใช่แนวทางในการตัดสินใจวินิจฉัยหรือการรักษา

History

การเพาะเลี้ยงเซลล์ได้เปลี่ยนแปลงวิชาไวรัสวิทยาหลังจาก Enders, Weller, และ Robbins แสดงให้เห็นในปี 1949 ว่าไวรัสโปลิโอสามารถเพาะเลี้ยงได้ในเนื้อเยื่อมนุษย์ที่ไม่ใช่ระบบประสาท ซึ่งเป็นผลงานที่ได้รับการยอมรับด้วยรางวัลโนเบลและเป็นรากฐานของไวรัสวิทยาการวินิจฉัยและวัคซีนสมัยใหม่ การแยกเชื้อโดยอาศัยการเพาะเลี้ยงในภายหลังทำให้สามารถค้นพบไวรัสในมนุษย์หลายชนิด รวมถึงโคโรนาไวรัสในมนุษย์ยุคแรก ก่อนที่วิธีการทางโมเลกุลจะเข้ามามีบทบาทหลัก

Key figures

• John Enders
• Thomas Weller
• Frederick Robbins

Seminal works

• enders-1949
• leland-ginocchio-2007

Frequently asked questions

ผลกระทบต่อเซลล์ (cytopathic effect) คืออะไร?

ผลกระทบต่อเซลล์คือความเสียหายที่มองเห็นได้ซึ่งไวรัสที่เพิ่มจำนวนทำให้เกิดกับเซลล์เพาะเลี้ยง — เช่น เซลล์กลมขึ้น, เซลล์หลุดลอก, การรวมตัวเป็นซินไซเทียม, หรือการเกิดอินคลูชันบอดี รูปแบบของผลกระทบนี้สามารถบ่งชี้ว่ามีไวรัสชนิดใดอยู่ และจะได้รับการยืนยันด้วยการย้อมสีเฉพาะหรือการทดสอบทางโมเลกุล

หากการทดสอบทางโมเลกุลเร็วกว่า เหตุใดจึงยังคงทำการเพาะเลี้ยงไวรัส?

การเพาะเลี้ยงจะกู้คืนไวรัสที่ติดเชื้อได้ ซึ่งจำเป็นสำหรับการศึกษาฟีโนไทป์ เช่น การจำแนกลักษณะทางแอนติเจน การทดสอบความไวต่อยาต้านไวรัส และการตรวจสอบเชื้อก่อโรคชนิดใหม่ — ซึ่งเป็นความสามารถที่การตรวจหาจีโนมหรือแอนติเจนเพียงอย่างเดียวไม่สามารถให้ได้