Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) — это молекулярно-цитогенетический метод, использующий меченые флуоресцентными метками ДНК-зонды для связывания со специфическими хромосомными последовательностями, которые затем визуализируются непосредственно на хромосомах или в клеточных ядрах под флуоресцентным микроскопом. Путем нацеливания на определенные локусы, а не сканирования всего генома, FISH с высокой чувствительностью обнаруживает и локализует специфические делеции, дупликации, перестройки и анеуплоидии, в том числе в неделящихся (интерфазных) клетках.

Definition

FISH — это метод, при котором меченый зонд нуклеиновой кислоты гибридизуется с комплементарными последовательностями, фиксированными на препарате хромосом или клеточном ядре, и детектируется по флуоресценции, что позволяет идентифицировать, подсчитывать или локализовать специфические геномные мишени.

Scope

Эта тема охватывает принцип гибридизации зондов, основные типы зондов и их применение (локус-специфические, центромерные и полнохромосомные «покрасочные» зонды), а также применение FISH к метафазным и интерфазным клеткам. Это методологический справочник, который не содержит рекомендаций по клиническому ведению.

Core questions

• Как меченый зонд обеспечивает специфическое, детектируемое связывание со своей хромосомной мишенью?
• Что отличает локус-специфические, центромерные и хромосомно-«покрасочные» зонды?
• Почему FISH может применяться как к интерфазным, так и к метафазным клеткам?
• Какие таргетные аномалии, которые не может разрешить бэндинг, выявляет FISH?

Key concepts

• Гибридизация нуклеиновых кислот
• Флуоресцентно меченый зонд
• Локус-специфический зонд
• Центромерный (альфа-сателлитный) зонд
• Полнохромосомный «покрасочный» зонд
• Интерфазный против метафазного FISH
• Специфичность зонда и подсчет сигналов
• Обнаружение микроделеций

Mechanisms

ДНК-зонд, комплементарный целевой последовательности, метится флуорофором (напрямую или через молекулу-репортер). Целевая хромосомная ДНК на предметном стекле и зонд денатурируются до одноцепочечных молекул, а затем им позволяют отожжечься, так что зонд гибридизуется со своей комплементарной последовательностью на месте. После отмывки несвязавшегося зонда связанный сигнал визуализируется с помощью флуоресцентной микроскопии. Различные конструкции зондов служат разным целям: локус-специфические зонды обнаруживают или подтверждают усиления, потери или перестройки в определенном гене или регионе; центромерные зонды подсчитывают копии данной хромосомы (определение анеуплоидии); а полнохромосомные «покрасочные» зонды метят всю хромосому для характеристики сложных перестроек. Поскольку гибридизация не требует делящихся клеток, FISH может быть выполнена на интерфазных ядрах, что расширяет анализ на ткани и образцы, из которых трудно получить метафазные препараты.

Clinical relevance

FISH используется для подтверждения или исключения специфических микроделеционных и микродупликационных состояний, для подсчета анеуплоидий и для обнаружения определенных перестроек, таких как те, которые характеризуют некоторые виды рака. Он дополняет кариотипирование, добавляя целенаправленное, высокочувствительное обнаружение, в том числе в интерфазных клетках. Эта статья описывает, как генерируются данные FISH; она не является основой для индивидуальных диагностических или лечебных решений.

Evidence & guidelines

Результаты FISH описываются в рамках Международной системы номенклатуры цитогеномных исследований человека (ISCN), которая включает обозначения для сигналов зондов и результатов гибридизации.

History

Гибридизация in situ была впервые разработана с использованием радиоактивных зондов в конце 1960-х годов. Переход к флуоресцентному обнаружению, количественно продемонстрированный Пинкелем, Страуме и Греем в 1986 году, дал более быстрый, безопасный и многоцветный метод и положил начало молекулярной цитогенетике. Последующие конструкции зондов и многоцветные подходы расширили применение FISH от обнаружения одного локуса до одновременного анализа многих мишеней, соединив классическую цитогенетику и молекулярную генетику.

Key figures

• Daniel Pinkel
• Joe W. Gray
• Michael Speicher
• Nigel Carter

Seminal works

• pinkel-1986
• speicher-carter-2005

Frequently asked questions

Чем FISH отличается от кариотипирования?

Кариотипирование сканирует весь геном с низким разрешением и выявляет сбалансированные перестройки и плоидность, тогда как FISH использует меченые зонды для исследования специфических локусов с высокой чувствительностью, в том числе в неделящихся интерфазных клетках. Это взаимодополняющие подходы.

Можно ли проводить FISH без делящихся клеток?

Да. Поскольку гибридизация не зависит от конденсации хромосом, FISH может применяться к интерфазным ядрам, что позволяет анализировать образцы, из которых трудно получить метафазные хромосомы.