Конфокальная и флуоресцентная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия позволяет получать изображения образцов путем возбуждения флуоресцентных молекул и сбора излучаемого ими света с большей длиной волны, что дает высококонтрастные, молекулярно-специфические изображения клеток. Конфокальная микроскопия добавляет диафрагму (пинхол), которая отсекает внефокусный свет, создавая четкие оптические срезы, которые могут быть объединены в трехмерные изображения клетки.

Definition

Флуоресцентная микроскопия использует поглощение и повторное излучение света флуорофорами для визуализации меченых структур; конфокальная микроскопия — это флуоресцентный метод, при котором диафрагма (пинхол) исключает внефокусный свет, так что только тонкая плоскость в фокусе вносит вклад в каждое изображение, что позволяет получать оптические срезы.

Scope

Данная статья охватывает принцип флуоресцентного контраста, преимущество конфокальной микроскопии в получении оптических срезов и широкий класс методов сверхразрешения, которые позволяют получать флуоресцентные изображения с разрешением ниже дифракционного предела. Эти методы рассматриваются как методы визуализации в клеточной биологии, а не как клинические инструкции.

Core questions

• Как флуоресценция обеспечивает молекулярный контраст в клетке?
• Как конфокальная диафрагма (пинхол) создает оптические срезы?
• Как реконструируются трехмерные изображения клеток?
• Как методы сверхразрешения превышают дифракционный предел?

Key concepts

• Возбуждение и эмиссия флуоресценции
• Флуорофоры и флуоресцентные белки
• Конфокальная диафрагма (пинхол) и оптическое секционирование
• Трехмерная реконструкция
• Фотообесцвечивание и фототоксичность
• Сверхразрешающая (неограниченная дифракцией) визуализация

Mechanisms

Во флуоресцентной микроскопии флуорофор поглощает возбуждающий свет и повторно излучает его на большей длине волны, который отделяется от возбуждающего света фильтрами для получения яркого, специфического контраста на темном фоне, как описано Lichtman и Conchello. Однако обычное флуоресцентное изображение содержит размывающий свет из областей выше и ниже фокальной плоскости; конфокальная микроскопия помещает диафрагму (пинхол) сопряженно с фокусной точкой, так что внефокусный свет отсекается, создавая оптические срезы, описанные Conchello и Lichtman, которые могут быть объединены в трехмерные изображения. Поскольку эмиссия, как и вся световая микроскопия, все еще подвержена дифракционному пределу, методы сверхразрешения, такие как микроскопия со стимулированным истощением излучения (stimulated-emission-depletion microscopy), предложенная Hell и Wichmann, манипулируют самим процессом флуоресценции для разрешения деталей значительно ниже этого предела, как показано Schermelleh и коллегами.

Clinical relevance

Конфокальная и флуоресцентная микроскопия широко используются в патологии, офтальмологии и биомедицинских исследованиях для локализации молекул и трехмерной визуализации тканей. Данная статья объясняет принципы визуализации и носит справочно-образовательный характер, не являясь основой для индивидуальных диагностических или лечебных решений.

History

Принцип конфокальной микроскопии был разработан Марвином Мински в 1950-х годах, но практические лазерные сканирующие конфокальные микроскопы и яркие синтетические и генетически кодируемые флуорофоры сделали флуоресцентную визуализацию доминирующей в клеточной биологии с конца двадцатого века. Последующее преодоление дифракционного предела с помощью микроскопии со стимулированным истощением излучения (Hell & Wichmann, 1994) и связанных с ней методов открыло эру флуоресцентной визуализации сверхвысокого разрешения, обобщенную Schermelleh и коллегами.

Key figures

• Jeff Lichtman
• Jose-Angel Conchello
• Stefan Hell
• Marvin Minsky

Seminal works

• lichtman-2005
• conchello-2005
• hell-1994
• schermelleh-2010

Frequently asked questions

Что делает конфокальная диафрагма (пинхол)?

Она расположена таким образом, что свет из-за пределов фокальной плоскости блокируется, оставляя только сфокусированный свет для формирования изображения; это создает тонкий оптический срез, который может быть объединен с другими в трехмерное изображение.

Как флуоресцентная микроскопия может преодолеть дифракционный предел?

Методы сверхразрешения, такие как микроскопия со стимулированным истощением излучения, контролируют процесс флуоресцентной эмиссии таким образом, что можно разрешать детали значительно ниже классического дифракционного предела.