Hybridation in situ en fluorescence (FISH)

L'hybridation in situ en fluorescence (FISH) est une technique de cytogénétique moléculaire qui utilise des sondes d'ADN marquées par fluorescence pour se lier à des séquences chromosomiques spécifiques, qui sont ensuite visualisées directement sur les chromosomes ou dans les noyaux cellulaires sous un microscope à fluorescence. En ciblant des loci définis plutôt qu'en balayant l'ensemble du génome, la FISH détecte et localise des délétions, duplications, réarrangements et aneuploïdies spécifiques avec une grande sensibilité, y compris dans les cellules non-divisantes (en interphase).

Definition

La FISH est une technique dans laquelle une sonde d'acide nucléique marquée est hybridée à des séquences complémentaires fixées sur une préparation chromosomique ou un noyau cellulaire et détectée par fluorescence, permettant d'identifier, de compter ou de localiser des cibles génomiques spécifiques.

Scope

Ce sujet aborde le principe de l'hybridation des sondes, les principaux types de sondes et leurs utilisations (sondes spécifiques de locus, centromériques et de peinture chromosomique complète), ainsi que l'application de la FISH aux cellules en métaphase et en interphase. Il s'agit d'une référence méthodologique et ne fournit pas de recommandations de prise en charge clinique.

Core questions

• Comment une sonde marquée réalise-t-elle une liaison spécifique et détectable à sa cible chromosomique ?
• Qu'est-ce qui distingue les sondes spécifiques de locus, centromériques et de peinture chromosomique ?
• Pourquoi la FISH peut-elle être appliquée aux cellules en interphase ainsi qu'aux cellules en métaphase ?
• Quelles anomalies ciblées la FISH permet-elle de résoudre que le caryotypage par bandes ne peut pas ?

Key concepts

• Hybridation d'acides nucléiques
• Sonde marquée par fluorescence
• Sonde spécifique de locus
• Sonde centromérique (alpha-satellite)
• Sonde de peinture chromosomique complète
• FISH en interphase versus en métaphase
• Spécificité de la sonde et comptage des signaux
• Détection de microdélétions

Mechanisms

Une sonde d'ADN complémentaire d'une séquence cible est marquée par un fluorophore (directement ou via une molécule rapporteur). L'ADN chromosomique cible sur une lame et la sonde sont dénaturés en brins simples, puis autorisés à s'hybrider, de sorte que la sonde se lie à sa séquence complémentaire in situ. Après élimination des sondes non liées par lavage, le signal lié est visualisé par microscopie à fluorescence. Différentes conceptions de sondes servent à des fins différentes : les sondes spécifiques de locus détectent ou confirment des gains, des pertes ou des réarrangements au niveau d'un gène ou d'une région définie ; les sondes centromériques comptent les copies d'un chromosome donné (énumération de l'aneuploïdie) ; et les sondes de peinture chromosomique complète marquent un chromosome entier pour caractériser des réarrangements complexes. Étant donné que l'hybridation ne nécessite pas de cellules en division, la FISH peut être réalisée sur des noyaux en interphase, étendant l'analyse aux tissus et échantillons pour lesquels les préparations en métaphase sont difficiles à obtenir.

Clinical relevance

La FISH est utilisée pour confirmer ou exclure des conditions spécifiques de microdélétion et de microduplication, pour énumérer les aneuploïdies, et pour détecter des réarrangements définis, tels que ceux caractérisant certains cancers. Elle complète le caryotypage en ajoutant une détection ciblée et de haute sensibilité, y compris dans les cellules en interphase. Cette entrée décrit comment les résultats de la FISH sont générés ; elle ne constitue pas une base pour des décisions diagnostiques ou thérapeutiques individuelles.

Evidence & guidelines

Les résultats de la FISH sont décrits dans le Système International de Nomenclature Cytogénomique Humaine (ISCN), qui inclut une notation pour les signaux de sonde et les résultats d'hybridation.

History

L'hybridation in situ a été développée pour la première fois avec des sondes radioactives à la fin des années 1960. Le passage à la détection par fluorescence, démontré quantitativement par Pinkel, Straume et Gray en 1986, a offert une méthode plus rapide, plus sûre et capable de multiples couleurs, et a lancé la cytogénétique moléculaire. Les conceptions de sondes ultérieures et les approches multicolores ont étendu la FISH de la détection d'un seul locus vers l'analyse simultanée de nombreuses cibles, faisant le pont entre la cytogénétique classique et la génétique moléculaire.

Key figures

• Daniel Pinkel
• Joe W. Gray
• Michael Speicher
• Nigel Carter

Seminal works

• pinkel-1986
• speicher-carter-2005

Frequently asked questions

En quoi la FISH diffère-t-elle du caryotypage ?

Le caryotypage balaye l'ensemble du génome à faible résolution et révèle les réarrangements équilibrés et la ploïdie, tandis que la FISH utilise des sondes marquées pour interroger des loci spécifiques avec une grande sensibilité, y compris dans les cellules en interphase non-divisantes. Ce sont des approches complémentaires.

La FISH peut-elle être réalisée sans cellules en division ?

Oui. Étant donné que l'hybridation ne dépend pas de la condensation chromosomique, la FISH peut être appliquée aux noyaux en interphase, permettant l'analyse d'échantillons à partir desquels les chromosomes en métaphase ne peuvent pas être facilement obtenus.