Microscopie confocale et à fluorescence

La microscopie à fluorescence permet d'imager des échantillons en excitant des molécules fluorescentes et en collectant la lumière de plus grande longueur d'onde qu'elles émettent, produisant des images cellulaires à contraste élevé et moléculairement spécifiques. La microscopie confocale ajoute un sténopé qui rejette la lumière hors foyer, produisant des coupes optiques nettes qui peuvent être assemblées pour former des vues tridimensionnelles de la cellule.

Definition

La microscopie à fluorescence utilise l'absorption et la réémission de lumière par les fluorophores pour imager des structures marquées ; la microscopie confocale est une technique de fluorescence dans laquelle un sténopé exclut la lumière hors foyer de sorte que seul un plan mince et net contribue à chaque image, produisant des coupes optiques.

Scope

Cette entrée couvre le principe du contraste de fluorescence, l'avantage de la coupe optique de l'imagerie confocale, et la vaste catégorie des méthodes de super-résolution qui repoussent l'imagerie par fluorescence en deçà de la limite de diffraction. Elle les traite comme des méthodes d'imagerie en biologie cellulaire et non comme des instructions cliniques.

Core questions

• Comment la fluorescence fournit-elle un contraste moléculaire dans une cellule ?
• Comment un sténopé confocal produit-il des coupes optiques ?
• Comment les images tridimensionnelles des cellules sont-elles reconstruites ?
• Comment les méthodes de super-résolution dépassent-elles la limite de diffraction ?

Key concepts

• Excitation et émission de fluorescence
• Fluorophores et protéines fluorescentes
• Sténopé confocal et coupe optique
• Reconstruction tridimensionnelle
• Photoblanchiment et phototoxicité
• Imagerie à super-résolution (sans limite de diffraction)

Mechanisms

En microscopie à fluorescence, un fluorophore absorbe la lumière d'excitation et la réémet à une longueur d'onde plus longue, laquelle est séparée de l'excitation par des filtres pour donner un contraste lumineux et spécifique sur un fond sombre, comme l'ont examiné Lichtman et Conchello. Une image de fluorescence conventionnelle, cependant, contient de la lumière floue provenant d'au-dessus et d'en dessous du plan focal ; la microscopie confocale place un sténopé conjugué au point focal de sorte que la lumière hors foyer est rejetée, produisant les coupes optiques décrites par Conchello et Lichtman qui peuvent être empilées en trois dimensions. Parce que l'émission, comme toute microscopie optique, est toujours soumise à la limite de diffraction, les approches de super-résolution telles que la microscopie à déplétion par émission stimulée (stimulated-emission-depletion microscopy), introduite par Hell et Wichmann, manipulent le processus de fluorescence lui-même pour résoudre des détails bien en deçà de cette limite, comme l'ont examiné Schermelleh et ses collègues.

Clinical relevance

La microscopie confocale et à fluorescence sont largement utilisées en pathologie, en ophtalmologie et en recherche biomédicale pour localiser des molécules et imager des tissus en trois dimensions. Cette entrée explique les principes d'imagerie impliqués et est à vocation éducative et de référence, et non une base pour des décisions individuelles de diagnostic ou de traitement.

History

Le principe confocal a été conçu par Marvin Minsky dans les années 1950, mais les microscopes confocaux à balayage laser pratiques et les fluorophores synthétiques et génétiquement encodés lumineux ont rendu l'imagerie par fluorescence dominante en biologie cellulaire à partir de la fin du XXe siècle. Le dépassement ultérieur de la limite de diffraction par la microscopie à déplétion par émission stimulée (stimulated-emission-depletion microscopy) (Hell & Wichmann, 1994) et les techniques connexes ont ouvert l'ère de l'imagerie par fluorescence à super-résolution, résumée par Schermelleh et ses collègues.

Key figures

• Jeff Lichtman
• Jose-Angel Conchello
• Stefan Hell
• Marvin Minsky

Seminal works

• lichtman-2005
• conchello-2005
• hell-1994
• schermelleh-2010

Frequently asked questions

Que fait le sténopé confocal ?

Il est positionné de manière à bloquer la lumière provenant de l'extérieur du plan focal, ne laissant passer que la lumière focalisée pour former l'image ; cela produit une fine coupe optique qui peut être combinée avec d'autres pour former une vue tridimensionnelle.

Comment la microscopie à fluorescence peut-elle dépasser la limite de diffraction ?

Les méthodes de super-résolution, telles que la microscopie à déplétion par émission stimulée (stimulated-emission-depletion microscopy), contrôlent le processus d'émission de fluorescence de sorte que des détails bien en deçà de la limite de diffraction classique puissent être résolus.