روشها و فناوریهای توالییابی RNA
توالییابی RNA (RNA-seq) با تبدیل RNA به یک کتابخانه توالییابی و شمارش خوانشهای حاصل که به ژنها و رونوشتها نگاشت میشوند، ترانسکریپتوم را اندازهگیری میکند. با نمونهبرداری مستقیم از رونوشتها به جای هیبرید کردن آنها با پروبهای از پیش تعریفشده، RNA-seq میتواند بیان را در یک محدوده دینامیکی وسیع کمیسازی کند، رونوشتهای قبلاً ناشناخته و محلهای اتصال (splice junctions) را کشف کند و ساختار ایزوفورم را مشخص نماید.
Definition
توالییابی RNA یک رویکرد توالییابی با توان عملیاتی بالا است که در آن RNA به صورت معکوس رونویسی میشود (یا مستقیماً توالییابی میشود) و خوانشهای حاصل نگاشت و شمارش میشوند تا فراوانی رونوشت کمیسازی شده و ساختار رونوشت در سراسر ترانسکریپتوم مشخص شود.
Scope
این موضوع به گردش کار تجربی و محاسباتی RNA-seq میپردازد: انتخاب RNA و آمادهسازی کتابخانه، شیمیهای توالییابی خوانش کوتاه و خوانش بلند، همترازسازی یا شبههمترازسازی خوانش، و کمیسازی و نرمالسازی بیان. این یک مرجع روششناختی در زمینه ترانسکریپتومیکس است و راهنمایی بالینی ارائه نمیدهد.
Core questions
- چگونه یک نمونه RNA به یک کتابخانه توالییابی تبدیل میشود و چه مراحل انتخابی (پلی-A یا حذف ریبوزومی) آنچه را که اندازهگیری میشود شکل میدهند؟
- چگونه خوانشها به یک مرجع همتراز یا شبههمتراز میشوند و به ازای هر ژن یا رونوشت کمیسازی میشوند؟
- چگونه نرمالسازی انجام میشود تا بیان در نمونههای مختلف قابل مقایسه باشد؟
- فناوریهای خوانش بلند و RNA مستقیم چه مزایایی نسبت به توالییابی خوانش کوتاه دارند؟
Key concepts
- آمادهسازی کتابخانه و انتخاب پلی-A یا حذف rRNA
- توالییابی خوانش کوتاه در مقابل خوانش بلند
- همترازسازی و شبههمترازسازی خوانش
- شمارش و کمیسازی خوانش
- نرمالسازی (به عنوان مثال، واحدهایی مانند FPKM/TPM)
- عمق توالییابی و پوشش
- تشخیص محل اتصال (splice-junction)
- توالییابی مستقیم RNA
Mechanisms
در یک گردش کار معمول، RNA استخراج شده و زیرمجموعهای از آن انتخاب میشود (معمولاً RNA پیامرسان پلیآدنیله، یا کل RNA پس از حذف RNA ریبوزومی)، قطعهقطعه شده، به DNA مکمل رونویسی معکوس میشود و به یک کتابخانه متصل به آداپتور تبدیل میگردد. کتابخانه توالییابی میشود تا میلیونها خوانش تولید شود که به یک ژنوم یا ترانسکریپتوم مرجع همتراز میشوند، یا با شبههمترازسازی بدون همترازسازی کمیسازی میشوند. خوانشهای همپوشان با هر ویژگی شمارش میشوند؛ از آنجا که رونوشتهای طولانیتر و نمونههای با توالییابی عمیقتر، خوانشهای بیشتری را جمعآوری میکنند، شمارشها برای طول رونوشت و اندازه کتابخانه قبل از مقایسه فراوانی، نرمالسازی میشوند. مورتازوی و همکاران چارچوب اصلی شمارش و نرمالسازی را معرفی کردند، و بررسیهای وانگ و اوزسولاک نقاط قوت و محدودیتهای این پلتفرم را بیان کردند. فناوریهای خوانش بلند و RNA مستقیم، مولکولهای کامل را توالییابی میکنند و وضوح ایزوفورم را با هزینه خطای بالاتر به ازای هر خوانش و توان عملیاتی کمتر بهبود میبخشند.
Clinical relevance
RNA-seq بخش عمدهای از شواهد طبقهبندی مولکولی و کشف نشانگرهای زیستی را در تحقیقات و ژنومیک ترجمهای تولید میکند و به طور فزایندهای از تشخیص رونوشت و همجوشی در تشخیص پشتیبانی میکند. به عنوان یک موضوع مرجع، توضیح میدهد که چگونه شواهد ترانسکریپتومیک تولید میشود؛ این مبنایی برای تصمیمات تشخیصی یا درمانی فردی نیست.
Evidence & guidelines
چارچوبهای بهترین عملکرد برای RNA-seq از کار بنیادی کمیسازی مورتازوی و همکاران و از بررسیهای روششناختی (وانگ و همکاران؛ اوزسولاک و میلوس) نشأت میگیرند. تحلیل خوانش بلند ملاحظات خاص خود را اضافه میکند که توسط آماراسینگه و همکاران بررسی شده است. اینها مراجع روششناختی هستند تا دستورالعملهای بالینی.
History
RNA-seq در سال ۲۰۰۸ با کاربرد توالییابی خوانش کوتاه با توان عملیاتی بالا بر روی RNA رونویسی معکوس شده ظهور کرد، و مورتازوی و همکاران نحوه نگاشت و کمیسازی ترانسکریپتومهای پستانداران را از شمارش خوانشها مشخص کردند. بررسیها در سالهای بعد، استانداردهای آمادهسازی کتابخانه و تحلیل را تثبیت کردند، و از اواسط دهه ۲۰۱۰ پلتفرمهای خوانش بلند و RNA مستقیم، این رویکرد را به سمت توالییابی ایزوفورم کامل گسترش دادند.
Debates
- توالییابی خوانش کوتاه در مقابل خوانش بلند
- خوانشهای کوتاه توان عملیاتی بالا و خطای کم به ازای هر باز را ارائه میدهند اما ایزوفورمها را تنها به طور غیرمستقیم بازسازی میکنند، در حالی که خوانشهای بلند رونوشتهای کامل را توالییابی کرده و ایزوفورمها را مستقیماً با هزینه نرخ خطای بالاتر و عمق کمتر مشخص میکنند؛ انتخاب مناسب بستگی به این دارد که آیا کمیسازی دقیق یا ساختار ایزوفورم اولویت دارد.
Key figures
- Barbara Wold
- Ali Mortazavi
- Michael Snyder
Related topics
Seminal works
- mortazavi-2008
- wang-2009
- ozsolak-2011
Frequently asked questions
- تفاوت بین انتخاب پلی-A و حذف RNA ریبوزومی چیست؟
- انتخاب پلی-A، RNA پیامرسان پلیآدنیله را به دام میاندازد و برای رونوشتهای کدکننده پروتئین کارآمد است، در حالی که حذف RNA ریبوزومی، rRNA فراوان را حذف میکند و در عین حال رونوشتهای غیرپلیآدنیله و تخریبشده را حفظ میکند. انتخاب این روشها تعیین میکند که کدام گونههای RNA در آزمایش قابل اندازهگیری هستند.
- چرا شمارشهای RNA-seq قبل از مقایسه نرمالسازی میشوند؟
- شمارشهای خام خوانش به طول رونوشت و عمق توالییابی هر نمونه بستگی دارد، بنابراین نمیتوان آنها را مستقیماً مقایسه کرد. نرمالسازی این عوامل را تنظیم میکند تا تفاوتها در فراوانی، منعکسکننده زیستشناسی باشند نه عمق فنی یا طول.
Methods for this concept
- RNA-seq Differential Expression
- Single-cell RNA-seq analysis
- De Novo Transcriptome Assembly
- Bayesian RNA-seq differential expression
- Time-series single-cell RNA-seq analysis
- Differential single-cell RNA-seq analysis
- Single-cell RNA-seq differential expression
- Machine learning-assisted RNA-seq differential expression