روشهای توالییابی DNA و RNA
روشهای توالییابی، ترتیب دقیق نوکلئوتیدها را در DNA یا، پس از تبدیل، در RNA تعیین میکنند. از شیمی خاتمه زنجیره سنگر تا پلتفرمهای موازی گسترده نسل بعدی، این تکنیکها به آسیبشناسی مولکولی اجازه میدهند تا ژنها را باز به باز بخواند، جهشها را شناسایی کند و بیان ژن را در مقیاس وسیع بررسی کند.
Definition
روشهای توالییابی DNA و RNA تکنیکهای آزمایشگاهی هستند که ترتیب خطی بازهای نوکلئوتیدی را در یک مولکول اسید نوکلئیک میخوانند؛ RNA معمولاً قبل از توالییابی به DNA مکمل رونویسی معکوس میشود.
Scope
این موضوع شامل توالییابی نسل اول (سنگر)، توالییابی نسل بعدی (موازی گسترده) و توالییابی RNA برای تحلیل ترانسکریپتوم، همراه با گردش کار عمومی آمادهسازی کتابخانه، توالییابی و همترازی خوانشها میشود. این مطلب به عنوان یک مرجع روششناختی ارائه شده است تا راهنمای آزمایش بالینی.
Key concepts
- توالییابی خاتمه زنجیره (سنگر)
- توالییابی نسل بعدی / موازی گسترده
- آمادهسازی کتابخانه
- خوانشها و پوشش توالییابی
- همترازی خوانشها و فراخوانی واریانت
- توالییابی RNA (ترانسکریپتومیکس)
- توالییابی هدفمند، اگزوم و کل ژنوم
Mechanisms
توالییابی سنگر، دیدئوکسینوکلئوتیدهای خاتمهدهنده زنجیره را برای تولید قطعاتی با هر طولی ترکیب میکند که بر اساس اندازه جدا میشوند تا توالی بازسازی شود (Sanger et al., 1977). توالییابی نسل بعدی به جای آن، کتابخانهای از DNA قطعهقطعه شده را آماده میکند، آن را به صورت فضایی تکثیر میکند و میلیونها قطعه را به صورت موازی توالییابی میکند، و کششهای کوتاهی را میخواند که سیگنالهای آنها به صورت محاسباتی مونتاژ میشوند (Margulies et al., 2005; Goodwin et al., 2016). توالییابی RNA همان رویکرد موازی را برای DNA مکمل مشتق شده از RNA به کار میبرد، ترانسکریپتها را کمیسازی میکند و الگوهای پیرایش و بیان را آشکار میسازد (Wang et al., 2009). خوانشها برای شناسایی واریانتها یا اندازهگیری فراوانی، با یک مرجع همتراز میشوند.
Clinical relevance
توالییابی از شناسایی واریانتهای مرتبط با بیماری و مشخصهیابی مولکولی تومورها و عوامل بیماریزا حمایت میکند. این مدخل توضیح میدهد که چگونه این روشها دادههای توالی را تولید میکنند و به عنوان یک مرجع در نظر گرفته شده است؛ در مورد انتخاب، تفسیر یا اقدام بر اساس آزمایشهای توالییابی در مراقبت از بیمار فردی توصیهای نمیکند.
Evidence & guidelines
این روشها بر پایه ادبیات اولیه بنیادی قرار دارند، از روش خاتمه زنجیره سنگر در سال 1977 تا اولین پلتفرم پیکولیتر با توان عملیاتی بالا (Margulies et al., 2005) و توالی ژنوم انسانی (Venter et al., 2001)، با بررسیهای بعدی که یک دهه از فناوریهای نسل بعدی و ظهور RNA-Seq را بررسی میکنند (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).
History
روش خاتمه زنجیره سنگر (1977) توالییابی DNA را به یک روش معمول تبدیل کرد و اساس اولین توالییابی ژنوم انسانی را فراهم آورد (Venter et al., 2001). معرفی توالییابی موازی گسترده در اواسط دهه 2000 به طور چشمگیری هزینه را کاهش داد و توان عملیاتی را افزایش داد (Margulies et al., 2005)، و در عرض یک دهه توالییابی نسل بعدی و RNA-Seq به ابزارهای استاندارد برای ژنومیکس و ترانسکریپتومیکس تبدیل شدند (Goodwin et al., 2016; Wang et al., 2009).
Key figures
- Frederick Sanger
- J. Craig Venter
- Marcel Margulies
Related topics
Seminal works
- sanger-1977
- margulies-2005
- goodwin-2016
Frequently asked questions
- توالییابی نسل بعدی چه تفاوتی با توالییابی سنگر دارد؟
- توالییابی سنگر یک قطعه DNA را در هر زمان با استفاده از شیمی خاتمه زنجیره میخواند، در حالی که توالییابی نسل بعدی میلیونها قطعه را به طور همزمان به صورت موازی گسترده میخواند، که به طور قابل توجهی توان عملیاتی را افزایش داده و هزینه هر باز را کاهش میدهد.
- آیا RNA را میتوان مستقیماً توالییابی کرد؟
- RNA معمولاً ابتدا با رونویسی معکوس به DNA مکمل تبدیل میشود و سپس توالییابی میگردد؛ این رویکرد RNA-Seq ترانسکریپتها را کمیسازی میکند و الگوهای پیرایش و بیان را آشکار میسازد.