ایمونوفلورسانس و مکانیابی پروتئین
ایمونوفلورسانس از آنتیبادیهای متصل به رنگهای فلورسنت برای یافتن مولکولهای خاص در سلولها و بافتها استفاده میکند، به طوری که یک پروتئین یا آنتیژن هدف در هر کجا که قرار دارد روشن میشود. این روش، ویژگی اتصال آنتیبادی را با کنتراست میکروسکوپ فلورسانس ترکیب میکند و یک روش اصلی برای نقشهبرداری از محل قرارگیری پروتئینها در سلول است.
Definition
ایمونوفلورسانس (تکنیک آنتیبادی فلورسنت) روشی است که در آن آنتیبادیهای کونژوگه شده با فلوروفورها به یک آنتیژن هدف متصل میشوند تا مکان آن در یک سلول یا بافت با میکروسکوپ فلورسانس قابل مشاهده باشد؛ مکانیابی پروتئین تعیین محل قرارگیری یک پروتئین مشخص در سلول است.
Scope
این مدخل اصول برچسبگذاری فلورسنت مبتنی بر آنتیبادی، طرحهای تشخیص مستقیم و غیرمستقیم، و استفاده از این روش برای مکانیابی پروتئینها در بخشهای سلولی را پوشش میدهد. این مدخل ایمونوفلورسانس را به عنوان یک روش مکانیابی در تصویربرداری سلولی بررسی میکند و نه به عنوان یک دستورالعمل بالینی.
Core questions
- چگونه یک آنتیبادی ویژگی مولکولی را به یک سیگنال فلورسنت منتقل میکند؟
- چه چیزی ایمونوفلورسانس مستقیم را از غیرمستقیم متمایز میکند؟
- چگونه یک پروتئین به یک بخش سلولی خاص اختصاص داده میشود؟
- چه کنترلهایی از سیگنالهای غیرخاص یا کاذب جلوگیری میکنند؟
Key concepts
- ویژگی آنتیبادی-آنتیژن
- کونژوگاسیون فلوروفور
- تشخیص مستقیم در مقابل غیرمستقیم
- هممکانیابی
- اختصاص به بخش زیرسلولی
- کنترلهای ویژگی
Mechanisms
یک آنتیبادی که علیه یک آنتیژن هدف تولید شده است، به یک رنگ فلورسنت متصل میشود، همانطور که برای اولین بار توسط کوونز و همکارانش نشان داده شد، به طوری که اتصال، موقعیت آنتیژن را با یک سیگنال فلورسنت قابل خواندن توسط میکروسکوپ مشخص میکند؛ کوونز و کاپلان روش بافت را اصلاح کردند تا آنتیژنها به طور قابل اعتمادی در سلولها شناسایی شوند. در ایمونوفلورسانس مستقیم، آنتیبادی برچسبگذاری شده به خود هدف متصل میشود، در حالی که در ایمونوفلورسانس غیرمستقیم، یک آنتیبادی اولیه بدون برچسب توسط یک آنتیبادی ثانویه برچسبگذاری شده شناسایی میشود که سیگنال را تقویت میکند. مکانیابی با توجه به محل قرارگیری سیگنال نسبت به نشانگرهای شناخته شده خوانده میشود، و جعبه ابزار فلورسنت گسترش یافته که توسط گیپمنز و همکارانش بررسی شده است — از جمله پروتئینهای فلورسنت — چنین مکانیابی را به سلولهای زنده گسترش میدهد، در حالی که روشهای فوقتفکیک که توسط شرمله و همکارانش بررسی شدهاند، آن را به زیر حد پراش (diffraction limit) دقیقتر میکنند. کنترلهای ویژگی برای تمایز اتصال واقعی از پسزمینه ضروری هستند.
Clinical relevance
ایمونوفلورسانس به صورت تشخیصی — به عنوان مثال در بیوپسیهای کلیه و پوست و در تشخیص خودایمنی — و به طور گسترده در تحقیقات برای مکانیابی پروتئینها استفاده میشود. این مدخل توضیح میدهد که چگونه سیگنال مکانیابی تولید و تفسیر میشود و جنبه آموزشی-مرجع دارد، نه مبنایی برای تصمیمگیریهای تشخیصی یا درمانی فردی.
History
آلبرت کوونز و همکارانش برچسبگذاری آنتیبادی فلورسنت را در حدود سال ۱۹۴۱ معرفی کردند و تا سال ۱۹۵۰ آن را برای تشخیص آنتیژن بافتی اصلاح کردند و ایمونوفلورسانس را بنیان نهادند. ظهور بعدی فلوروفورهای روشن و پروتئینهای فلورسنت کدگذاری شده ژنتیکی، که در جعبه ابزار فلورسنت گیپمنز و همکارانش فهرست شدهاند، و تصویربرداری فوقتفکیک، دقت مکانیابی پروتئینها در سلولها را به شدت افزایش داد.
Key figures
- Albert Coons
- Roger Tsien
- Mark Ellisman
Related topics
Seminal works
- coons-1941
- coons-1950
- giepmans-2006
Frequently asked questions
- تفاوت بین ایمونوفلورسانس مستقیم و غیرمستقیم چیست؟
- در ایمونوفلورسانس مستقیم، فلوروفور به آنتیبادی متصل است که به هدف متصل میشود؛ در ایمونوفلورسانس غیرمستقیم، یک آنتیبادی ثانویه برچسبگذاری شده، یک آنتیبادی اولیه بدون برچسب را شناسایی میکند که سیگنال را تقویت میکند.
- ایمونوفلورسانس چگونه نشان میدهد که یک پروتئین در کجای سلول قرار دارد؟
- آنتیبادی فقط به آنتیژن خاص خود متصل میشود، بنابراین سیگنال فلورسنت در هر کجا که آن پروتئین قرار دارد ظاهر میشود و موقعیت آن نسبت به نشانگرهای سلولی شناخته شده، بخش سلولی را که اشغال میکند، آشکار میسازد.