Análisis Cuantitativo en Tiempo Real y Evaluación del Número de Copias

Los métodos moleculares cuantitativos miden la cantidad de un ácido nucleico objetivo presente, en lugar de simplemente determinar si es detectable. La PCR cuantitativa en tiempo real rastrea la amplificación a medida que ocurre, la PCR digital divide una muestra para contar las moléculas de forma absoluta, y la evaluación del número de copias determina si una región genómica se ha ganado o perdido.

Definition

El análisis cuantitativo en tiempo real mide la cantidad de un ácido nucleico objetivo, generalmente mediante el monitoreo de la señal fluorescente durante la amplificación (PCR en tiempo real) o mediante el recuento de particiones positivas (PCR digital); la evaluación del número de copias determina el número de copias de una región genómica en relación con una referencia.

Scope

El tema abarca la PCR en tiempo real (cuantitativa), la PCR digital y la PCR digital de gotas, así como los enfoques para la evaluación del número de copias. Aborda los principios de cuantificación y las consideraciones que hacen que los resultados sean comparables, presentados como material de referencia metodológico en lugar de como guía para pruebas clínicas.

Key concepts

• PCR en tiempo real (cuantitativa)
• Ciclo de cuantificación (Cq) y eficiencia de amplificación
• Curvas estándar y cuantificación relativa
• PCR digital y PCR digital de gotas
• Cuantificación absoluta por partición
• Ganancias y pérdidas del número de copias
• Estándares de notificación y reproducibilidad

Mechanisms

La PCR en tiempo real acopla la amplificación a un reportero fluorescente cuya señal aumenta en proporción a la acumulación del producto; el ciclo en el que la señal cruza un umbral refleja la cantidad inicial del objetivo, lo que permite la cuantificación relativa o mediante curva estándar (Heid et al., 1996). La PCR digital, en cambio, distribuye la muestra en muchas particiones diminutas de modo que cada una contiene cero o unas pocas moléculas; el recuento de la fracción de particiones positivas y la aplicación de estadísticas de Poisson producen un recuento absoluto sin una curva estándar (Hindson et al., 2011). La evaluación del número de copias compara la abundancia de una región objetivo con una referencia para detectar amplificaciones o deleciones, una idea iniciada por la hibridación genómica comparativa (Kallioniemi et al., 1992).

Clinical relevance

Los métodos cuantitativos y de número de copias se utilizan para medir la carga patógena, la expresión génica y las ganancias o pérdidas genómicas. Esta entrada explica cómo funciona la cuantificación como referencia metodológica; no asesora sobre la selección, interpretación o actuación sobre ningún ensayo cuantitativo específico en la atención al paciente.

Evidence & guidelines

La notificación de la PCR cuantitativa se guía por las recomendaciones MIQE, que especifican la información mínima necesaria para una publicación reproducible (Bustin et al., 2009). Estudios primarios fundamentales describen la cuantificación en tiempo real (Heid et al., 1996), la cuantificación digital absoluta (Hindson et al., 2011) y la medición del número de copias en todo el genoma (Kallioniemi et al., 1992).

History

La PCR en tiempo real a mediados de la década de 1990 convirtió la amplificación de una herramienta cualitativa en una cuantitativa (Heid et al., 1996), y los estándares de notificación consensuados surgieron una década después (Bustin et al., 2009). La PCR digital, y especialmente la PCR digital de gotas, permitió entonces el recuento absoluto de moléculas con alta precisión (Hindson et al., 2011), mientras que la evaluación del número de copias evolucionó de la hibridación genómica comparativa hacia métodos basados en matrices y secuenciación (Kallioniemi et al., 1992).

Key figures

• Christian Heid
• Stephen Bustin
• Benjamin Hindson

Seminal works

• heid-1996
• hindson-2011
• bustin-2009

Frequently asked questions

¿En qué se diferencia la PCR digital de la PCR cuantitativa en tiempo real?

La PCR en tiempo real estima la cantidad inicial del objetivo a partir de cuán temprano la señal fluorescente cruza un umbral, generalmente en relación con un estándar, mientras que la PCR digital divide la muestra y cuenta los compartimentos positivos para dar un recuento absoluto de moléculas sin una curva estándar.

¿Qué mide la evaluación del número de copias?

Determina cuántas copias de una región genómica particular están presentes en relación con una referencia, identificando amplificaciones (ganancias) o deleciones (pérdidas) de esa región.