PCR y técnicas de amplificación de ácidos nucleicos

Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos copian una secuencia elegida de ADN o ARN muchas veces para que un objetivo presente en cantidades mínimas se vuelva detectable y medible. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es el arquetipo: a través de ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión por polimerasa, produce un aumento exponencial en una secuencia definida, lo que la convierte en una piedra angular del diagnóstico molecular.

Definition

Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos son métodos in vitro que generan enzimáticamente muchas copias de una secuencia específica de ADN o ARN, utilizando la PCR el ciclado térmico y una ADN polimerasa para amplificar una región definida por dos cebadores.

Scope

El tema abarca la PCR convencional de punto final, la PCR en tiempo real (cuantitativa), la PCR con transcriptasa inversa para objetivos de ARN y alternativas isotérmicas como la amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP). Aborda los principios, componentes y consideraciones de informe de la amplificación como referencia metodológica, no como protocolos de ensayo o guía clínica.

Key concepts

• Ciclado térmico (desnaturalización, hibridación, extensión)
• Cebadores y ADN polimerasa
• Amplificación exponencial
• PCR con transcriptasa inversa para objetivos de ARN
• PCR en tiempo real (cuantitativa)
• Amplificación isotérmica (por ejemplo, LAMP)
• Control de contaminación y falsos positivos

Mechanisms

En la PCR, el ADN de doble cadena se desnaturaliza por calor en cadenas simples, cebadores de oligonucleótidos cortos se hibridan a secuencias que flanquean el objetivo, y una ADN polimerasa termoestable extiende los cebadores para sintetizar nuevas cadenas complementarias; la repetición del ciclo duplica el objetivo en cada ronda, produciendo una amplificación exponencial (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). Los objetivos de ARN se convierten primero en ADN complementario mediante transcriptasa inversa antes de la amplificación. La PCR en tiempo real monitorea la acumulación del producto ciclo por ciclo utilizando reporteros fluorescentes, lo que permite la cuantificación (Heid et al., 1996). Los métodos isotérmicos, como la amplificación isotérmica mediada por bucles, amplifican a una sola temperatura, evitando la necesidad de ciclado térmico (Notomi et al., 2000).

Clinical relevance

Las técnicas de amplificación se utilizan ampliamente para detectar patógenos y caracterizar objetivos genéticos en laboratorios de diagnóstico. Esta entrada describe cómo funciona la amplificación y cómo se informa su rendimiento; es una referencia metodológica y no proporciona orientación para solicitar o interpretar ninguna prueba particular en la atención al paciente.

Evidence & guidelines

Las directrices MIQE (Bustin et al., 2009) establecen la información mínima necesaria para informar experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real y son una referencia ampliamente citada para la transparencia y la reproducibilidad. Estudios primarios fundamentales describen el método original de PCR y la cuantificación en tiempo real (Saiki et al., 1985; Heid et al., 1996), mientras que trabajos posteriores introdujeron alternativas isotérmicas (Notomi et al., 2000).

History

La PCR fue concebida por Kary Mullis y aplicada por primera vez a un problema de diagnóstico —la detección de la mutación de células falciformes— por Saiki y sus colegas en 1985, con el método descrito formalmente en 1986 (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). La introducción de polimerasas termoestables automatizó el proceso, y la detección en tiempo real en la década de 1990 añadió capacidad cuantitativa (Heid et al., 1996). Las técnicas isotérmicas ampliaron posteriormente la amplificación a entornos sin termocicladores (Notomi et al., 2000).

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki-1985
• heid-1996
• bustin-2009

Frequently asked questions

¿Por qué la PCR amplifica un objetivo exponencialmente?

Cada ciclo copia cada cadena existente del objetivo, por lo que el número de copias se duplica aproximadamente en cada ronda; después de muchos ciclos, una secuencia que comenzó como unas pocas moléculas puede alcanzar miles de millones de copias.

¿Cómo difiere la amplificación isotérmica de la PCR?

Los métodos isotérmicos, como la amplificación isotérmica mediada por bucles, amplifican el ADN a una única temperatura constante utilizando cebadores y enzimas especializados, eliminando la necesidad de los ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que requiere la PCR convencional.