Aplicaciones de la PCR en tiempo real y la PCR cuantitativa

La PCR en tiempo real, también llamada PCR cuantitativa (qPCR), mide la acumulación de ADN amplificado ciclo a ciclo a través de una señal fluorescente, lo que permite estimar la cantidad inicial de una secuencia diana. Combinada con la retrotranscripción (RT-qPCR), es uno de los métodos más utilizados para cuantificar la expresión génica en patología molecular.

Definition

La PCR cuantitativa en tiempo real es un método de amplificación de ácidos nucleicos que monitoriza la formación del producto en tiempo real mediante fluorescencia, utilizando el ciclo de cuantificación para estimar la cantidad inicial de un ADN o (después de la retrotranscripción) un ARN diana.

Scope

Este tema abarca el principio de medición de la PCR en tiempo real, el ciclo de cuantificación (Cq) y su relación con la cantidad de molde, la cuantificación relativa mediante el método comparativo 2-ΔΔCT, el papel de los genes de referencia y la eficiencia de amplificación, y los estándares de notificación que rigen la reproducibilidad. También se menciona la PCR digital como un enfoque relacionado de cuantificación absoluta. Se abordan estos aspectos como métodos de laboratorio, no como protocolos de pruebas clínicas.

Core questions

• ¿Cómo se relaciona el ciclo de cuantificación con la cantidad de molde inicial?
• ¿Cómo se calcula y normaliza la expresión relativa en la RT-qPCR?
• ¿Por qué la eficiencia de amplificación y la elección del gen de referencia afectan el resultado?
• ¿Cómo difiere la PCR digital de la PCR en tiempo real en la consecución de la cuantificación?

Key concepts

• Ciclo de cuantificación (Cq / Ct)
• Eficiencia de amplificación
• Método comparativo 2-ΔΔCT
• Genes de referencia (de mantenimiento)
• qPCR con retrotranscripción
• PCR digital y partición
• Estándares de notificación MIQE

Mechanisms

Durante la PCR, la secuencia diana se duplica en cada ciclo en la fase exponencial, y un reportero fluorescente (un colorante intercalante o una sonda específica de secuencia) emite una señal proporcional al producto acumulado. El ciclo en el que la fluorescencia cruza un umbral definido (el ciclo de cuantificación, Cq o Ct) está inversamente relacionado con el logaritmo de la cantidad inicial de molde, por lo que un Cq más bajo significa más diana. La expresión relativa se calcula más comúnmente con el método comparativo 2-ΔΔCT, que normaliza el Cq de la diana a un gen de referencia y a una muestra calibradora, asumiendo eficiencias de amplificación casi iguales (Livak & Schmittgen, 2001). Dado que la eficiencia, la estabilidad del gen de referencia y la variabilidad de la retrotranscripción afectan la estimación, las directrices MIQE especifican los detalles experimentales y la validación necesarios para que un resultado sea interpretable (Bustin et al., 2009). La PCR digital, en cambio, divide la muestra en muchas reacciones y cuenta las particiones positivas, lo que proporciona una cuantificación absoluta sin una curva estándar (Huggett et al., 2013).

Clinical relevance

La RT-qPCR es una plataforma rutinaria para medir los niveles de transcritos que subyacen a los resultados de diagnóstico y pronóstico molecular, y la comprensión de sus supuestos es parte de la interpretación de los informes de laboratorio. Esta entrada explica el método y sus limitaciones y no es una base para los puntos de corte diagnósticos o el manejo del paciente, que dependen de ensayos validados.

Evidence & guidelines

Las expectativas de notificación y calidad para la PCR en tiempo real se establecen en las directrices MIQE (Bustin et al., 2009) y, para la PCR digital, en las directrices MIQE digitales (Huggett et al., 2013). El método comparativo 2-ΔΔCT (Livak & Schmittgen, 2001) sigue siendo la referencia estándar para la cuantificación relativa.

History

La PCR en tiempo real surgió en la década de 1990 cuando la detección fluorescente se acopló al ciclado térmico, reemplazando la cuantificación de punto final que requería mucha mano de obra. El método comparativo 2-ΔΔCT (2001) estandarizó la cuantificación relativa, las directrices MIQE (2009) abordaron problemas generalizados de reproducibilidad, y la PCR digital amplió posteriormente el campo hacia la cuantificación absoluta.

Debates

¿Cómo deben elegirse los genes de referencia para la normalización?

La cuantificación relativa asume una expresión génica de referencia estable en todas las condiciones, pero los genes de mantenimiento individuales pueden variar; se recomienda el uso de múltiples genes de referencia validados para evitar una normalización sesgada.

Key figures

• Stephen Bustin
• Kenneth Livak
• Thomas Schmittgen
• Jim Huggett

Seminal works

• livak-2001
• bustin-2009
• huggett-2013

Frequently asked questions

¿Qué significa un valor de Ct más bajo?

Un ciclo de cuantificación (Ct o Cq) más bajo significa que la fluorescencia cruza el umbral antes, lo que indica una mayor cantidad de molde diana inicial; el Ct está inversamente relacionado con el logaritmo de la cantidad inicial.

¿En qué se diferencia la PCR digital de la qPCR en tiempo real?

La PCR digital divide la reacción en muchos compartimentos pequeños y cuenta cuántos contienen la diana, lo que proporciona un recuento absoluto sin una curva estándar, mientras que la qPCR en tiempo real infiere la cantidad a partir del ciclo de cuantificación, generalmente como una medida relativa.