Diagnóstico Molecular: PCR y Secuenciación

Los métodos moleculares permiten detectar e identificar hongos a través de sus ácidos nucleicos, en lugar de basarse en su crecimiento o apariencia. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica el ADN fúngico de muestras o aislados, y la secuenciación de regiones conservadas, especialmente el espaciador transcrito interno (ITS) del grupo de genes ribosomales, lee el ADN amplificado para identificar el organismo, a menudo de manera más rápida y precisa que el cultivo.

Definition

El diagnóstico molecular para hongos comprende técnicas que amplifican y analizan los ácidos nucleicos fúngicos, utilizando la PCR para detectar ADN fúngico y la secuenciación de ADN de regiones conservadas, como el espaciador transcrito interno, para identificar el organismo a nivel de género o especie.

Scope

Este tema abarca la PCR específica de especie y de amplio espectro (panfúngica), la PCR en tiempo real, la secuenciación de ADN de regiones de código de barras como el ITS, y el uso de estos métodos en aislados de cultivo y directamente en material clínico, incluyendo tejido fijado en formalina. Se enmarcan como métodos de identificación y detección y no ofrecen instrucciones de pruebas o tratamiento.

Core questions

• ¿Está presente ADN fúngico en esta muestra y de qué organismo procede?
• ¿Cuándo es preferible la PCR panfúngica de amplio espectro a un ensayo específico de especie?
• ¿Qué región genómica discrimina mejor los hongos de interés?
• ¿Cómo se interpretan los resultados moleculares dados los riesgos de contaminación y de detección de ADN no viable?

Key concepts

• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
• PCR específica de especie versus PCR de amplio espectro (panfúngica)
• PCR en tiempo real (cuantitativa)
• Espaciador transcrito interno (ITS) como código de barras fúngico
• Secuenciación de ADN y bases de datos de referencia
• Detección en aislados versus directamente en tejido
• Control de la contaminación e interpretación del ADN libre de células

Mechanisms

La PCR utiliza cebadores (primers) y una polimerasa termoestable para amplificar el ADN diana a través de ciclos repetidos, generando suficientes copias para detectar incluso pequeñas cantidades de material genético fúngico. Los ensayos específicos de especie se dirigen a un organismo conocido, mientras que los ensayos de amplio espectro o panfúngicos utilizan cebadores contra regiones conservadas compartidas por muchos hongos, tras lo cual la secuenciación revela la identidad. La región del espaciador transcrito interno (ITS) del grupo de genes de ARN ribosomal, flanqueada por cebadores conservados descritos por White y colaboradores, es lo suficientemente variable entre especies como para actuar como un código de barras fúngico universal, y la secuencia leída se compara con bases de datos de referencia para identificar el organismo. La PCR en tiempo real añade cuantificación y velocidad, y los ensayos pueden realizarse en aislados cultivados o directamente en muestras clínicas, incluyendo tejido fijado en formalina, aunque el ADN degradado y la contaminación ambiental complican la interpretación. Dado que la PCR detecta ADN en lugar de células viables, los resultados se interpretan junto con los hallazgos de cultivo, microscopía y antígenos.

Clinical relevance

La detección molecular y la secuenciación sustentan cada vez más la forma en que se identifican los hongos y cómo se reconocen algunas infecciones, y ciertos resultados de PCR contribuyen a las categorías de consenso de enfermedad fúngica invasiva probable. Esta entrada describe los métodos y sus advertencias interpretativas como material de referencia y no dirige las pruebas ni la atención al paciente.

Evidence & guidelines

Las definiciones de consenso de la EORTC/MSGERC incorporan resultados específicos de PCR entre los criterios micológicos para la enfermedad fúngica invasiva probable, lo que refleja la maduración de los métodos moleculares, mientras que las recomendaciones de mejores prácticas describen su lugar junto con el cultivo y las pruebas de antígenos. El enfoque de secuenciación del ITS se remonta a los cebadores ampliamente utilizados publicados por White y colaboradores.

History

Después de que la reacción en cadena de la polimerasa se desarrollara en la década de 1980, su aplicación a los hongos avanzó rápidamente cuando White y colaboradores publicaron, en 1990, cebadores para amplificar y secuenciar directamente los genes de ARN ribosomal fúngico, estableciendo la región ITS como un marcador filogenético y, posteriormente, diagnóstico. La PCR en tiempo real, los ensayos panfúngicos de amplio espectro y la secuenciación de alto rendimiento extendieron posteriormente la micología molecular de la investigación a la identificación y detección rutinarias.

Seminal works

• white-1990
• donnelly-2020

Frequently asked questions

¿Qué es la región ITS y por qué se utiliza para identificar hongos?

El espaciador transcrito interno (ITS) es una parte del grupo de genes ribosomales fúngicos que varía lo suficiente entre especies, a la vez que está flanqueado por secuencias conservadas, lo que lo convierte en un código de barras universal práctico para la identificación fúngica basada en secuenciación.

¿Una PCR fúngica positiva demuestra una infección activa?

No por sí sola. La PCR detecta ADN fúngico, que puede persistir después de que los organismos ya no sean viables o surgir de la contaminación, por lo que los resultados moleculares se interpretan junto con el cultivo, la microscopía y las pruebas de antígenos, y dentro de las definiciones diagnósticas estandarizadas.