Chẩn đoán phân tử: PCR, RT-PCR và Khuếch đại axit nucleic

Chẩn đoán phân tử phát hiện vi rút bằng cách khuếch đại và nhận dạng axit nucleic của nó. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và, đối với vi rút RNA, PCR phiên mã ngược (RT-PCR) sao chép một trình tự bộ gen mục tiêu hàng triệu lần để ngay cả một lượng rất nhỏ bộ gen vi rút cũng có thể được phát hiện, mang lại cho các phương pháp này độ nhạy và độ đặc hiệu cao, khiến chúng trở thành trụ cột của chẩn đoán vi rút hiện đại.

Definition

Chẩn đoán phân tử là việc phát hiện và, khi cần, định lượng axit nucleic của vi rút bằng các kỹ thuật khuếch đại như PCR, RT-PCR và các phương pháp đẳng nhiệt, sao chép một mục tiêu bộ gen cụ thể đến mức có thể phát hiện được.

Scope

Chủ đề này bao gồm các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic được sử dụng trong virus học: PCR thông thường và thời gian thực, PCR phiên mã ngược cho vi rút RNA, đo lường định lượng tải lượng vi rút và các lựa chọn thay thế đẳng nhiệt như khuếch đại qua trung gian vòng lặp. Nó giải thích các nguyên tắc và cách diễn giải ở cấp độ tham chiếu và không cung cấp các giao thức xét nghiệm hoặc lời khuyên quản lý lâm sàng.

Core questions

• Làm thế nào để khuếch đại một trình tự mục tiêu giúp phát hiện vi rút từ một lượng khởi đầu rất nhỏ?
• Vi rút RNA yêu cầu bước bổ sung nào so với vi rút DNA?
• PCR thời gian thực được sử dụng như thế nào để định lượng tải lượng vi rút, và ngưỡng chu kỳ có ý nghĩa gì?
• Khi nào các định dạng đẳng nhiệt hoặc đa hợp được ưu tiên hơn PCR thông thường?

Key concepts

• Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
• Phiên mã ngược (RT-PCR)
• Mồi và tính đặc hiệu mục tiêu
• Chu trình nhiệt và khuếch đại theo cấp số nhân
• PCR thời gian thực (định lượng)
• Ngưỡng chu kỳ và tải lượng vi rút
• Khuếch đại đa hợp
• Khuếch đại đẳng nhiệt (ví dụ: LAMP)

Mechanisms

PCR sử dụng hai mồi ngắn kẹp một vùng đã chọn của bộ gen vi rút, một DNA polymerase bền nhiệt và các chu trình gia nhiệt và làm mát lặp đi lặp lại. Mỗi chu trình biến tính DNA, bắt cặp mồi và kéo dài các sợi mới, nhân đôi mục tiêu để nó tích lũy theo cấp số nhân. Đối với vi rút RNA, một bước phiên mã ngược đầu tiên chuyển đổi bộ gen RNA thành DNA bổ sung trước khi khuếch đại. PCR thời gian thực theo dõi sự tích lũy sản phẩm theo từng chu kỳ bằng cách sử dụng các chất báo cáo huỳnh quang, cho phép định lượng: ngưỡng chu kỳ mà tại đó tín hiệu tăng lên trên nền có liên quan nghịch với lượng khuôn ban đầu, đưa ra ước tính tải lượng vi rút. Các thiết kế đa hợp khuếch đại nhiều mục tiêu cùng một lúc, và các phương pháp đẳng nhiệt như khuếch đại qua trung gian vòng lặp đạt được sự khuếch đại ở nhiệt độ không đổi, giảm yêu cầu về thiết bị cho xét nghiệm phi tập trung.

Clinical relevance

Khuếch đại axit nucleic cung cấp khả năng phát hiện nhạy và đặc hiệu nhiễm vi rút hoạt động và hỗ trợ theo dõi tải lượng vi rút được sử dụng để theo dõi nhiễm trùng và đáp ứng điều trị. Mục này mô tả cách các phương pháp hoạt động và cách các kết quả như ngưỡng chu kỳ được diễn giải về nguyên tắc, bao gồm cả điểm mà việc phát hiện bộ gen không tự nó chứng minh vi rút lây nhiễm có mặt; nó mang tính mô tả về phương pháp luận và không phải là cơ sở cho các quyết định chẩn đoán hoặc điều trị cá nhân.

Epidemiology

RT-PCR thời gian thực đã trở thành phương pháp tham chiếu để xác nhận nhiễm SARS-CoV-2, và việc công bố nhanh chóng các xét nghiệm đã được xác nhận vào đầu năm 2020 đã cho phép mở rộng quy mô xét nghiệm phân tử trên toàn cầu, minh họa cách khuếch đại axit nucleic là nền tảng cho việc phát hiện và giám sát dịch bệnh.

History

Phản ứng chuỗi polymerase được Kary Mullis hình thành và lần đầu tiên được Saiki và các đồng nghiệp áp dụng vào chẩn đoán di truyền vào năm 1985, với phương pháp được Mullis và Faloona chính thức hóa vào năm 1987. PCR định lượng thời gian thực, được Heid và các đồng nghiệp mô tả vào năm 1996, đã bổ sung định lượng liên tục, và các phương pháp đẳng nhiệt như khuếch đại qua trung gian vòng lặp, được Notomi và các đồng nghiệp giới thiệu vào năm 2000, đã mở rộng nơi có thể thực hiện khuếch đại.

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Christian Drosten

Seminal works

• saiki-1985
• mullis-faloona-1987
• heid-1996
• corman-2020

Frequently asked questions

Sự khác biệt giữa PCR và RT-PCR là gì?

PCR khuếch đại DNA, vì vậy nó được sử dụng trực tiếp cho các vi rút DNA. RT-PCR bổ sung một bước phiên mã ngược chuyển đổi bộ gen RNA của vi rút thành DNA bổ sung trước, cho phép phát hiện các vi rút RNA như cúm và coronavirus.

Kết quả PCR dương tính có nghĩa là vi rút lây nhiễm có mặt không?

Không nhất thiết. PCR phát hiện bộ gen của vi rút, có thể tồn tại sau khi vi rút không còn nhân lên hoặc lây nhiễm. Việc xác định sự hiện diện của vi rút lây nhiễm đòi hỏi nuôi cấy hoặc các xét nghiệm chức năng khác được diễn giải trong bối cảnh lâm sàng.