PCR và các Kỹ thuật Khuếch đại Axit Nucleic

Các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic sao chép một trình tự DNA hoặc RNA đã chọn nhiều lần để một mục tiêu hiện diện với lượng rất nhỏ có thể được phát hiện và đo lường. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là kỹ thuật điển hình: thông qua các chu kỳ biến tính, gắn mồi và kéo dài bởi polymerase lặp đi lặp lại, nó tạo ra sự gia tăng theo cấp số nhân của một trình tự xác định, trở thành nền tảng của chẩn đoán phân tử.

Definition

Các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic là các phương pháp in vitro tạo ra nhiều bản sao của một trình tự DNA hoặc RNA cụ thể bằng enzyme, trong đó PCR sử dụng chu trình nhiệt và DNA polymerase để khuếch đại một vùng được xác định bởi hai mồi.

Scope

Chủ đề này bao gồm PCR điểm cuối thông thường, PCR thời gian thực (định lượng), PCR phiên mã ngược cho các mục tiêu RNA và các lựa chọn thay thế đẳng nhiệt như khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng (loop-mediated isothermal amplification). Nó đề cập đến các nguyên tắc, thành phần và các cân nhắc báo cáo của quá trình khuếch đại như một tài liệu tham khảo về phương pháp luận, không phải là các quy trình xét nghiệm hoặc hướng dẫn lâm sàng.

Key concepts

• Chu trình nhiệt (biến tính, gắn mồi, kéo dài)
• Mồi và DNA polymerase
• Khuếch đại theo cấp số nhân
• PCR phiên mã ngược cho các mục tiêu RNA
• PCR thời gian thực (định lượng)
• Khuếch đại đẳng nhiệt (ví dụ: LAMP)
• Kiểm soát nhiễm bẩn và dương tính giả

Mechanisms

Trong PCR, DNA sợi đôi được biến tính nhiệt thành các sợi đơn, các mồi oligonucleotide ngắn gắn vào các trình tự nằm cạnh mục tiêu, và một DNA polymerase bền nhiệt kéo dài các mồi để tổng hợp các sợi bổ sung mới; việc lặp lại chu kỳ này làm tăng gấp đôi mục tiêu mỗi vòng, tạo ra sự khuếch đại theo cấp số nhân (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). Các mục tiêu RNA trước tiên được chuyển đổi thành DNA bổ sung bằng enzyme phiên mã ngược trước khi khuếch đại. PCR thời gian thực theo dõi sự tích lũy sản phẩm theo từng chu kỳ bằng cách sử dụng các chất phát huỳnh quang, cho phép định lượng (Heid et al., 1996). Các phương pháp đẳng nhiệt như khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng khuếch đại ở một nhiệt độ duy nhất, tránh nhu cầu về chu trình nhiệt (Notomi et al., 2000).

Clinical relevance

Các kỹ thuật khuếch đại được sử dụng rộng rãi để phát hiện mầm bệnh và đặc trưng các mục tiêu di truyền trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán. Mục này mô tả cách thức hoạt động của quá trình khuếch đại và cách báo cáo hiệu suất của nó; đây là một tài liệu tham khảo về phương pháp luận và không cung cấp hướng dẫn về việc đặt hàng hoặc diễn giải bất kỳ xét nghiệm cụ thể nào trong chăm sóc bệnh nhân.

Evidence & guidelines

Hướng dẫn MIQE (Bustin et al., 2009) đưa ra thông tin tối thiểu cần thiết để báo cáo các thí nghiệm PCR định lượng thời gian thực và là một tài liệu tham khảo được trích dẫn rộng rãi về tính minh bạch và khả năng tái lập. Các nghiên cứu cơ bản ban đầu mô tả phương pháp PCR gốc và định lượng thời gian thực (Saiki et al., 1985; Heid et al., 1996), trong khi các công trình sau này đã giới thiệu các lựa chọn thay thế đẳng nhiệt (Notomi et al., 2000).

History

PCR được Kary Mullis hình thành và lần đầu tiên được Saiki và các đồng nghiệp áp dụng vào một vấn đề chẩn đoán — phát hiện đột biến hồng cầu hình liềm — vào năm 1985, với phương pháp được mô tả chính thức vào năm 1986 (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986). Việc giới thiệu các polymerase bền nhiệt đã tự động hóa quy trình, và phát hiện thời gian thực vào những năm 1990 đã bổ sung khả năng định lượng (Heid et al., 1996). Các kỹ thuật đẳng nhiệt sau đó đã mở rộng khả năng khuếch đại đến các môi trường không có máy luân nhiệt (Notomi et al., 2000).

Key figures

• Kary Mullis
• Randall Saiki
• Henry Erlich

Seminal works

• saiki-1985
• heid-1996
• bustin-2009

Frequently asked questions

Tại sao PCR khuếch đại một mục tiêu theo cấp số nhân?

Mỗi chu kỳ sao chép mọi sợi hiện có của mục tiêu, vì vậy số lượng bản sao tăng gấp đôi mỗi vòng; sau nhiều chu kỳ, một trình tự bắt đầu từ vài phân tử có thể đạt đến hàng tỷ bản sao.

Khuếch đại đẳng nhiệt khác với PCR như thế nào?

Các phương pháp đẳng nhiệt như khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng khuếch đại DNA ở một nhiệt độ không đổi duy nhất bằng cách sử dụng các mồi và enzyme chuyên biệt, loại bỏ nhu cầu về các chu kỳ làm nóng và làm lạnh lặp đi lặp lại mà PCR thông thường yêu cầu.