Chẩn đoán phân tử: PCR và Giải trình tự

Các phương pháp phân tử phát hiện và nhận dạng nấm dựa trên axit nucleic của chúng thay vì dựa vào sự phát triển hoặc hình thái. Phản ứng chuỗi polymerase khuếch đại DNA nấm từ các mẫu vật hoặc chủng phân lập, và giải trình tự các vùng bảo tồn, đặc biệt là vùng đệm phiên mã nội bộ (internal transcribed spacer - ITS) của cụm gen ribosome, đọc DNA đã khuếch đại để định danh sinh vật, thường nhanh hơn và chính xác hơn so với nuôi cấy.

Definition

Chẩn đoán phân tử cho nấm là các kỹ thuật khuếch đại và phân tích axit nucleic của nấm, sử dụng PCR để phát hiện DNA nấm và giải trình tự DNA của các vùng bảo tồn như vùng đệm phiên mã nội bộ để xác định sinh vật đến chi hoặc loài.

Scope

Chủ đề này bao gồm PCR đặc hiệu loài và PCR phổ rộng (panfungal), PCR thời gian thực, giải trình tự DNA của các vùng mã vạch như ITS, và việc sử dụng các phương pháp này trên các chủng phân lập nuôi cấy và trực tiếp trên vật liệu lâm sàng, bao gồm mô cố định formalin. Nó định hình chúng như các phương pháp nhận dạng và phát hiện và không đưa ra hướng dẫn xét nghiệm hoặc điều trị.

Core questions

• DNA nấm có hiện diện trong mẫu vật này không, và nó đến từ sinh vật nào?
• Khi nào PCR panfungal phổ rộng được ưu tiên hơn xét nghiệm đặc hiệu loài?
• Vùng gen nào phân biệt tốt nhất các loại nấm quan tâm?
• Kết quả phân tử được giải thích như thế nào khi có nguy cơ ô nhiễm và phát hiện DNA không khả thi?

Key concepts

• Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
• PCR đặc hiệu loài so với PCR phổ rộng (panfungal)
• PCR thời gian thực (định lượng)
• Vùng đệm phiên mã nội bộ (ITS) như một mã vạch nấm
• Giải trình tự DNA và cơ sở dữ liệu tham chiếu
• Phát hiện trên chủng phân lập so với trực tiếp trên mô
• Kiểm soát ô nhiễm và giải thích DNA không có tế bào

Mechanisms

PCR sử dụng các mồi (primer) và một polymerase bền nhiệt để khuếch đại DNA mục tiêu thông qua các chu kỳ lặp lại, tạo ra đủ bản sao để phát hiện ngay cả một lượng nhỏ vật liệu di truyền của nấm. Các xét nghiệm đặc hiệu loài nhắm mục tiêu vào một sinh vật đã biết, trong khi các xét nghiệm phổ rộng hoặc panfungal sử dụng các mồi chống lại các vùng bảo tồn được chia sẻ bởi nhiều loại nấm, sau đó giải trình tự sẽ tiết lộ danh tính. Vùng đệm phiên mã nội bộ của cụm gen RNA ribosome, được bao quanh bởi các mồi bảo tồn được mô tả bởi White và các đồng nghiệp, đủ biến đổi giữa các loài để hoạt động như một mã vạch nấm phổ quát, và trình tự đọc được đối chiếu với các cơ sở dữ liệu tham chiếu để định danh sinh vật. PCR thời gian thực bổ sung khả năng định lượng và tốc độ, và các xét nghiệm có thể được thực hiện trên các chủng phân lập nuôi cấy hoặc trực tiếp trên các mẫu lâm sàng, bao gồm mô cố định formalin, mặc dù DNA bị phân hủy và ô nhiễm môi trường làm phức tạp việc giải thích. Bởi vì PCR phát hiện DNA chứ không phải các tế bào sống, kết quả được đọc cùng với nuôi cấy, kính hiển vi và các phát hiện kháng nguyên.

Clinical relevance

Phát hiện và giải trình tự phân tử ngày càng củng cố cách nấm được xác định và cách một số bệnh nhiễm trùng được nhận biết, và một số kết quả PCR góp phần vào các danh mục đồng thuận về bệnh nấm xâm lấn có thể xảy ra. Mục này mô tả các phương pháp và các lưu ý giải thích của chúng như tài liệu tham khảo và không chỉ đạo xét nghiệm hoặc chăm sóc bệnh nhân.

Evidence & guidelines

Các định nghĩa đồng thuận từ EORTC/MSGERC kết hợp các kết quả PCR cụ thể vào các tiêu chí nấm học cho bệnh nấm xâm lấn có thể xảy ra, phản ánh sự trưởng thành của các phương pháp phân tử, trong khi các khuyến nghị thực hành tốt nhất mô tả vị trí của chúng cùng với nuôi cấy và xét nghiệm kháng nguyên. Phương pháp giải trình tự ITS bắt nguồn từ các mồi được sử dụng rộng rãi do White và các đồng nghiệp công bố.

History

Sau khi phản ứng chuỗi polymerase được phát triển vào những năm 1980, ứng dụng của nó vào nấm đã tiến bộ nhanh chóng khi White và các đồng nghiệp công bố, vào năm 1990, các mồi để khuếch đại và giải trình tự trực tiếp các gen RNA ribosome của nấm, thiết lập vùng ITS như một dấu hiệu phát sinh loài và sau đó là dấu hiệu chẩn đoán. PCR thời gian thực, các xét nghiệm panfungal phổ rộng và giải trình tự thông lượng cao sau đó đã mở rộng nấm học phân tử từ nghiên cứu sang nhận dạng và phát hiện thường quy.

Seminal works

• white-1990
• donnelly-2020

Frequently asked questions

Vùng ITS là gì và tại sao nó được sử dụng để nhận dạng nấm?

Vùng đệm phiên mã nội bộ (ITS) là một phần của cụm gen ribosome của nấm, biến đổi đủ giữa các loài trong khi được bao quanh bởi các trình tự bảo tồn, làm cho nó trở thành một mã vạch phổ quát thực tế để nhận dạng nấm dựa trên giải trình tự.

Một kết quả PCR nấm dương tính có chứng minh nhiễm trùng đang hoạt động không?

Không phải riêng nó. PCR phát hiện DNA nấm, có thể tồn tại sau khi sinh vật không còn khả thi hoặc phát sinh từ ô nhiễm, vì vậy kết quả phân tử được giải thích cùng với nuôi cấy, kính hiển vi và các xét nghiệm kháng nguyên và trong các định nghĩa chẩn đoán tiêu chuẩn hóa.