Các Phương pháp Hiển vi và Nhuộm nấm

Kính hiển vi trực tiếp và nhuộm cho phép phòng thí nghiệm quan sát các yếu tố nấm trong mẫu vật mà không cần chờ nuôi cấy. Các tiêu bản ướt đơn giản, chất làm sáng huỳnh quang và thuốc nhuộm mô cho thấy sợi nấm, nấm men và bào tử, cung cấp bằng chứng nhanh chóng về sự hiện diện của nấm và, trong mô, về sự xâm lấn.

Definition

Các phương pháp hiển vi và nhuộm nấm là các kỹ thuật làm cho cấu trúc nấm hiển thị trong các mẫu lâm sàng hoặc lát cắt mô, sử dụng các tác nhân làm trong, chất liên kết thành tế bào huỳnh quang hoặc thuốc nhuộm hóa mô để hiển thị sợi nấm, nấm men và bào tử dưới kính hiển vi quang học hoặc huỳnh quang.

Scope

Chủ đề này bao gồm các phương pháp hình dung nấm: tiêu bản ướt kali hydroxit làm trong mẫu vật, thuốc nhuộm huỳnh quang như calcofluor white liên kết với thành tế bào nấm, và thuốc nhuộm mô học được sử dụng trên các lát cắt mô. Nó cũng bao gồm những gì hình thái học có thể và không thể cho người quan sát biết về danh tính. Đây là tài liệu tham khảo phương pháp mô tả, không phải là giao thức chẩn đoán hoặc điều trị.

Core questions

• Các yếu tố nấm có hiện diện trong mẫu vật này không, và chúng có hình thái học như thế nào?
• Thuốc nhuộm nào thể hiện nấm tốt nhất trong tiêu bản ướt so với lát cắt mô?
• Hình thái học đơn thuần có thể thu hẹp danh tính của nấm đến mức nào?
• Kính hiển vi có cho thấy sự xâm lấn mô trái ngược với sự xâm chiếm bề mặt không?

Key concepts

• Tiêu bản ướt kali hydroxit (KOH)
• Thuốc nhuộm huỳnh quang calcofluor white
• Thuốc nhuộm periodic acid-Schiff (PAS)
• Thuốc nhuộm Grocott-Gomori methenamine silver (GMS)
• Sợi nấm, nấm men và sợi nấm giả
• Xâm lấn mô so với xâm chiếm
• Giới hạn của việc xác định hình thái học

Mechanisms

Trong tiêu bản KOH, kali hydroxit hòa tan keratin và các vật liệu chủ khác, để lại thành nấm khúc xạ có thể nhìn thấy dưới kính hiển vi. Các chất làm sáng huỳnh quang như calcofluor white liên kết chitin và cellulose trong thành tế bào nấm và phát huỳnh quang dưới ánh sáng cực tím, làm nổi bật rõ ràng sợi nấm và nấm men trên nền tối. Trong mô, các thuốc nhuộm đặc biệt khai thác thành tế bào giàu polysaccharid: periodic acid-Schiff làm nổi bật thành nấm màu đỏ tươi, và Grocott-Gomori methenamine silver lắng đọng bạc để làm chúng có màu đen, cho phép nhìn thấy nấm trong các lát cắt và, quan trọng hơn, đánh giá chúng là xâm lấn mô. Hình thái học, kiểu phân nhánh của sợi nấm, sự hiện diện của nấm men hoặc sợi nấm giả, và vách ngăn, thu hẹp chẩn đoán phân biệt nhưng hiếm khi đặc hiệu cho loài, vì vậy kính hiển vi được kết hợp với nuôi cấy, kháng nguyên hoặc các phương pháp phân tử để xác định danh tính cuối cùng.

Clinical relevance

Kính hiển vi cung cấp một số bằng chứng nhanh nhất cho thấy nấm có mặt và, trong mô, rằng nó đang xâm lấn, điều này là trung tâm để nhận biết bệnh nấm xâm lấn. Mục này giải thích các phương pháp và giới hạn diễn giải của chúng như tài liệu tham khảo; nó không hướng dẫn về chuẩn bị mẫu vật hoặc quản lý bệnh nhân.

Evidence & guidelines

Các đánh giá về mô bệnh học nấm ghi lại các thuốc nhuộm được sử dụng để hiển thị nấm trong mô và các manh mối hình thái, cũng như giới hạn, của việc xác định sinh vật bằng hình dạng. Các khuyến nghị thực hành tốt nhất để chẩn đoán bệnh nấm nghiêm trọng đặt kính hiển vi trực tiếp và nhuộm huỳnh quang là các phương pháp tiền tuyến nhanh chóng được sử dụng cùng với nuôi cấy và xét nghiệm phân tử.

History

Kính hiển vi trực tiếp là một trong những phương pháp nấm học lâu đời nhất, với tiêu bản ướt KOH từ lâu đã được sử dụng để chứng minh nấm da và các loại nấm khác. Các thuốc nhuộm hóa mô như Grocott-Gomori methenamine silver và periodic acid-Schiff đã trở thành tiêu chuẩn trong thế kỷ XX để hiển thị nấm trong mô, và các chất làm sáng huỳnh quang sau đó đã tăng thêm độ nhạy bằng cách làm cho thành tế bào phát sáng dưới ánh sáng cực tím.

Seminal works

• guarner-2011
• dehoog-2020

Frequently asked questions

Kính hiển vi có thể xác định chính xác loài nấm không?

Thông thường là không. Kính hiển vi có thể cho thấy nấm có mặt và gợi ý các loại rộng như nấm men hoặc nấm mốc, nhưng việc xác định loài chính xác thường đòi hỏi nuôi cấy, khối phổ hoặc giải trình tự DNA.

Tại sao calcofluor white hữu ích để nhìn thấy nấm?

Calcofluor white liên kết các thành phần của thành tế bào nấm và phát huỳnh quang dưới ánh sáng cực tím, làm cho ngay cả sợi nấm và nấm men thưa thớt cũng nổi bật rõ ràng, điều này cải thiện khả năng phát hiện so với tiêu bản ướt không nhuộm.