วิธีการทางจุลทรรศน์และการย้อมสีสำหรับเชื้อรา

การตรวจด้วยจุลทรรศน์โดยตรงและการย้อมสีช่วยให้ห้องปฏิบัติการสามารถมองเห็นองค์ประกอบของเชื้อราในตัวอย่างได้โดยไม่ต้องรอผลการเพาะเลี้ยง การเตรียมสไลด์แบบเปียกอย่างง่าย สารเรืองแสง และการย้อมสีเนื้อเยื่อสามารถเผยให้เห็นเส้นใยรา ยีสต์ และสปอร์ ซึ่งให้หลักฐานอย่างรวดเร็วถึงการมีอยู่ของเชื้อรา และในเนื้อเยื่อ ยังบ่งชี้ถึงการรุกรานอีกด้วย

Definition

วิธีการทางจุลทรรศน์และการย้อมสีสำหรับเชื้อราคือเทคนิคที่ทำให้โครงสร้างของเชื้อรามองเห็นได้ในตัวอย่างทางคลินิกหรือส่วนตัดเนื้อเยื่อ โดยใช้สารทำให้ใส สารยึดผนังเซลล์เรืองแสง หรือการย้อมสีทางเคมีเนื้อเยื่อ เพื่อแสดงเส้นใยรา ยีสต์ และสปอร์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงหรือแบบเรืองแสง

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมวิธีการมองเห็นเชื้อรา: การเตรียมสไลด์เปียกด้วยโพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ที่ช่วยให้ตัวอย่างใสขึ้น, การย้อมสีเรืองแสง เช่น แคลโคฟลูออร์ไวท์ที่จับกับผนังเซลล์ของเชื้อรา, และการย้อมสีทางจุลพยาธิวิทยาที่ใช้กับส่วนตัดเนื้อเยื่อ นอกจากนี้ยังครอบคลุมถึงสิ่งที่สัณฐานวิทยาบอกได้และบอกไม่ได้เกี่ยวกับการระบุชนิดเชื้อราแก่ผู้สังเกตการณ์ นี่คือข้อมูลอ้างอิงวิธีการเชิงพรรณนา ไม่ใช่ระเบียบวิธีวินิจฉัยหรือการรักษา

Core questions

• มีองค์ประกอบของเชื้อราอยู่ในตัวอย่างนี้หรือไม่ และมีลักษณะทางสัณฐานวิทยาเป็นอย่างไร?
• การย้อมสีใดที่แสดงเชื้อราได้ดีที่สุดในการเตรียมสไลด์เปียกเทียบกับส่วนตัดเนื้อเยื่อ?
• สัณฐานวิทยาเพียงอย่างเดียวสามารถจำกัดชนิดของเชื้อราได้มากน้อยเพียงใด?
• การตรวจด้วยจุลทรรศน์แสดงการรุกรานเนื้อเยื่อเมื่อเทียบกับการตั้งรกรากบนพื้นผิวหรือไม่?

Key concepts

• การเตรียมสไลด์เปียกด้วยโพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ (KOH)
• การย้อมสีเรืองแสงแคลโคฟลูออร์ไวท์ (Calcofluor white)
• การย้อมสีกรดพรีออดิก-ชิฟฟ์ (PAS)
• การย้อมสีโกรคอตต์-โกโมริ เมทเทนามีน ซิลเวอร์ (GMS)
• เส้นใยรา ยีสต์ และซูโดไฮฟา
• การรุกรานเนื้อเยื่อเทียบกับการตั้งรกราก
• ข้อจำกัดของการระบุชนิดด้วยสัณฐานวิทยา

Mechanisms

ในการเตรียม KOH โพแทสเซียมไฮดรอกไซด์จะละลายเคราตินและสารอื่นๆ ของโฮสต์ ทำให้ผนังเซลล์ของเชื้อราที่หักเหแสงได้มองเห็นได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ สารเรืองแสง เช่น แคลโคฟลูออร์ไวท์ จะจับกับไคตินและเซลลูโลสในผนังเซลล์ของเชื้อราและเรืองแสงภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต ทำให้เห็นเส้นใยราและยีสต์ได้อย่างชัดเจนตัดกับพื้นหลังสีเข้ม ในเนื้อเยื่อ การย้อมสีพิเศษจะใช้ประโยชน์จากผนังเซลล์ที่อุดมด้วยโพลีแซคคาไรด์: กรดพรีออดิก-ชิฟฟ์ (periodic acid-Schiff) จะเน้นผนังเซลล์ของเชื้อราให้เป็นสีม่วงแดง และโกรคอตต์-โกโมริ เมทเทนามีน ซิลเวอร์ (Grocott-Gomori methenamine silver) จะสะสมเงินทำให้ผนังเซลล์เป็นสีดำ ซึ่งช่วยให้มองเห็นเชื้อราภายในส่วนตัดเนื้อเยื่อ และที่สำคัญคือสามารถตัดสินได้ว่ามีการรุกรานเนื้อเยื่อหรือไม่ สัณฐานวิทยา รูปแบบการแตกแขนงของเส้นใยรา การมีอยู่ของยีสต์หรือซูโดไฮฟา (pseudohyphae) และการมีผนังกั้น (septation) ช่วยจำกัดความเป็นไปได้ แต่ไม่ค่อยจำเพาะเจาะจงกับชนิดเชื้อรา ดังนั้นการตรวจด้วยจุลทรรศน์จึงมักใช้ร่วมกับการเพาะเลี้ยง แอนติเจน หรือวิธีการทางโมเลกุลเพื่อการระบุชนิดที่แน่นอน

Clinical relevance

การตรวจด้วยจุลทรรศน์ให้หลักฐานที่รวดเร็วที่สุดบางอย่างว่ามีเชื้อราอยู่ และในเนื้อเยื่อนั้นมีการรุกราน ซึ่งเป็นหัวใจสำคัญของการรับรู้โรคเชื้อราที่รุกราน ข้อมูลนี้อธิบายวิธีการและข้อจำกัดในการตีความเพื่อเป็นข้อมูลอ้างอิง ไม่ได้ให้คำแนะนำเกี่ยวกับการเตรียมตัวอย่างหรือการจัดการผู้ป่วย

Evidence & guidelines

บทวิจารณ์เกี่ยวกับจุลพยาธิวิทยาของเชื้อราได้บันทึกการย้อมสีที่ใช้ในการแสดงเชื้อราในเนื้อเยื่อ และเบาะแสทางสัณฐานวิทยา รวมถึงข้อจำกัดของการระบุสิ่งมีชีวิตด้วยรูปลักษณ์ภายนอก คำแนะนำแนวปฏิบัติที่ดีที่สุดสำหรับการวินิจฉัยโรคเชื้อราที่รุนแรงได้กำหนดให้การตรวจด้วยจุลทรรศน์โดยตรงและการย้อมสีเรืองแสงเป็นวิธีการแนวหน้าอย่างรวดเร็วที่ใช้ร่วมกับการเพาะเลี้ยงและการทดสอบทางโมเลกุล

History

การตรวจด้วยจุลทรรศน์โดยตรงเป็นหนึ่งในวิธีการทางวิทยาเชื้อราที่เก่าแก่ที่สุด โดยมีการใช้การเตรียมสไลด์เปียกด้วย KOH มานานเพื่อแสดงเดอร์มาโตไฟต์ (dermatophytes) และเชื้อราอื่นๆ การย้อมสีทางเคมีเนื้อเยื่อ เช่น วิธีโกรคอตต์-โกโมริ เมทเทนามีน ซิลเวอร์ และกรดพรีออดิก-ชิฟฟ์ ได้กลายเป็นมาตรฐานในศตวรรษที่ยี่สิบสำหรับการแสดงเชื้อราในเนื้อเยื่อ และสารเรืองแสงในภายหลังได้เพิ่มความไวโดยทำให้ผนังเซลล์เรืองแสงภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต

Seminal works

• guarner-2011
• dehoog-2020

Frequently asked questions

การตรวจด้วยจุลทรรศน์สามารถระบุชนิดของเชื้อราได้อย่างแม่นยำหรือไม่?

โดยทั่วไปแล้วไม่ การตรวจด้วยจุลทรรศน์สามารถแสดงให้เห็นว่ามีเชื้อราอยู่และแนะนำประเภทกว้างๆ เช่น ยีสต์หรือรา แต่การระบุชนิดที่แม่นยำมักจะต้องใช้การเพาะเลี้ยง แมสสเปกโทรเมทรี หรือการจัดลำดับดีเอ็นเอ

ทำไมแคลโคฟลูออร์ไวท์จึงมีประโยชน์ในการมองเห็นเชื้อรา?

แคลโคฟลูออร์ไวท์จะจับกับส่วนประกอบของผนังเซลล์ของเชื้อราและเรืองแสงภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต ทำให้แม้แต่เส้นใยราและยีสต์ที่กระจัดกระจายก็ยังโดดเด่นอย่างสว่างไสว ซึ่งช่วยเพิ่มการตรวจจับเมื่อเทียบกับการเตรียมสไลด์เปียกที่ไม่ได้ย้อมสี