อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์และการระบุตำแหน่งโปรตีน

อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ใช้แอนติบอดีที่เชื่อมต่อกับสีย้อมเรืองแสงเพื่อค้นหาโมเลกุลจำเพาะภายในเซลล์และเนื้อเยื่อ ทำให้โปรตีนเป้าหมายหรือแอนติเจนสว่างขึ้นในตำแหน่งที่อยู่ วิธีนี้เป็นการรวมความจำเพาะของการจับของแอนติบอดีเข้ากับความคมชัดของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนส์ และเป็นวิธีการหลักในการทำแผนที่ตำแหน่งของโปรตีนในเซลล์

Definition

อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ (เทคนิคแอนติบอดีเรืองแสง) เป็นวิธีการที่แอนติบอดีที่เชื่อมต่อกับฟลูออโรฟอร์จับกับแอนติเจนเป้าหมาย เพื่อให้สามารถมองเห็นตำแหน่งของแอนติเจนนั้นภายในเซลล์หรือเนื้อเยื่อได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนส์ ส่วนการระบุตำแหน่งโปรตีนคือการกำหนดว่าโปรตีนที่กำหนดนั้นอยู่ส่วนใดของเซลล์

Scope

บทความนี้ครอบคลุมหลักการของการติดฉลากเรืองแสงด้วยแอนติบอดี แผนการตรวจจับทั้งแบบตรงและแบบอ้อม และการใช้วิธีการนี้ในการระบุตำแหน่งโปรตีนในส่วนประกอบของเซลล์ โดยถือว่าอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์เป็นวิธีการระบุตำแหน่งในการถ่ายภาพเซลล์ ไม่ใช่คำแนะนำทางคลินิก

Core questions

• แอนติบอดีให้ความจำเพาะระดับโมเลกุลแก่สัญญาณเรืองแสงได้อย่างไร?
• อะไรคือความแตกต่างระหว่างอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์แบบตรงและแบบอ้อม?
• โปรตีนถูกกำหนดให้อยู่ในส่วนประกอบของเซลล์ที่เฉพาะเจาะจงได้อย่างไร?
• การควบคุมใดบ้างที่ป้องกันสัญญาณที่ไม่จำเพาะเจาะจงหรือสัญญาณปลอม?

Key concepts

• ความจำเพาะของแอนติบอดี-แอนติเจน
• การเชื่อมต่อฟลูออโรฟอร์
• การตรวจจับแบบตรงเทียบกับแบบอ้อม
• การอยู่ร่วมกัน (Co-localization)
• การกำหนดส่วนประกอบย่อยของเซลล์
• การควบคุมความจำเพาะ

Mechanisms

แอนติบอดีที่สร้างขึ้นเพื่อต่อต้านแอนติเจนเป้าหมายจะถูกเชื่อมต่อกับสีย้อมเรืองแสง ดังที่ Coons และคณะได้แสดงให้เห็นเป็นครั้งแรก เพื่อให้การจับนั้นทำเครื่องหมายตำแหน่งของแอนติเจนด้วยสัญญาณเรืองแสงที่สามารถอ่านได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์ Coons และ Kaplan ได้ปรับปรุงวิธีการในเนื้อเยื่อเพื่อให้สามารถตรวจจับแอนติเจนในเซลล์ได้อย่างน่าเชื่อถือ ในอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์แบบตรง แอนติบอดีที่ติดฉลากจะจับกับเป้าหมายโดยตรง ในขณะที่ในอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์แบบอ้อม แอนติบอดีปฐมภูมิที่ไม่ติดฉลากจะถูกตรวจจับโดยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ติดฉลาก ซึ่งเป็นการขยายสัญญาณ การระบุตำแหน่งจะอ่านได้จากตำแหน่งที่สัญญาณปรากฏเมื่อเทียบกับเครื่องหมายที่ทราบ และชุดเครื่องมือเรืองแสงที่ขยายออกไปซึ่ง Giepmans และคณะได้ทบทวน — รวมถึงโปรตีนเรืองแสง — ช่วยขยายการระบุตำแหน่งดังกล่าวไปยังเซลล์ที่มีชีวิต ในขณะที่วิธีการความละเอียดสูงพิเศษที่ Schermelleh และคณะได้สำรวจช่วยให้มีความคมชัดยิ่งขึ้นต่ำกว่าขีดจำกัดการเลี้ยวเบน การควบคุมความจำเพาะเป็นสิ่งจำเป็นเพื่อแยกแยะการจับที่แท้จริงออกจากสัญญาณรบกวน

Clinical relevance

อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ถูกนำมาใช้ในการวินิจฉัย — เช่น ในการตรวจชิ้นเนื้อไตและผิวหนัง และในการตรวจหาออโตแอนติบอดี — และใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิจัยเพื่อระบุตำแหน่งโปรตีน บทความนี้อธิบายถึงวิธีการสร้างและตีความสัญญาณการระบุตำแหน่ง และเป็นข้อมูลอ้างอิงเพื่อการศึกษา ไม่ใช่พื้นฐานสำหรับการตัดสินใจในการวินิจฉัยหรือการรักษาเฉพาะบุคคล

History

Albert Coons และคณะได้นำเสนอการติดฉลากแอนติบอดีเรืองแสงประมาณปี 1941 และปรับปรุงให้ใช้สำหรับการตรวจจับแอนติเจนในเนื้อเยื่อได้ภายในปี 1950 ซึ่งเป็นการก่อตั้งอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ การมาถึงของฟลูออโรฟอร์ที่สว่างขึ้นและโปรตีนเรืองแสงที่เข้ารหัสทางพันธุกรรม ซึ่งถูกจัดทำเป็นรายการในชุดเครื่องมือเรืองแสงของ Giepmans และคณะ และการถ่ายภาพความละเอียดสูงพิเศษ ได้ขยายความแม่นยำในการระบุตำแหน่งโปรตีนในเซลล์อย่างมาก

Key figures

• Albert Coons
• Roger Tsien
• Mark Ellisman

Seminal works

• coons-1941
• coons-1950
• giepmans-2006

Frequently asked questions

อะไรคือความแตกต่างระหว่างอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์แบบตรงและแบบอ้อม?

ในอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์แบบตรง ฟลูออโรฟอร์จะติดอยู่กับแอนติบอดีที่จับกับเป้าหมาย ในขณะที่ในอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์แบบอ้อม แอนติบอดีทุติยภูมิที่ติดฉลากจะตรวจจับแอนติบอดีปฐมภูมิที่ไม่ติดฉลาก ซึ่งเป็นการขยายสัญญาณ

อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์แสดงตำแหน่งของโปรตีนในเซลล์ได้อย่างไร?

แอนติบอดีจะจับกับแอนติเจนจำเพาะของมันเท่านั้น ดังนั้นสัญญาณเรืองแสงจะปรากฏขึ้นในตำแหน่งที่โปรตีนนั้นอยู่ และตำแหน่งของมันเมื่อเทียบกับเครื่องหมายเซลล์ที่ทราบจะเผยให้เห็นส่วนประกอบที่โปรตีนนั้นครอบครองอยู่