อิมมูโนฮิสโตเคมีและอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์

อิมมูโนฮิสโตเคมี (Immunohistochemistry, IHC) และอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ (immunofluorescence) ใช้แอนติบอดีเพื่อระบุตำแหน่งของโมเลกุลจำเพาะภายในชิ้นเนื้อ แอนติบอดีจะจับกับแอนติเจนเป้าหมายในแหล่งกำเนิด (in situ) จากนั้นจะถูกทำให้มองเห็นได้ — โดยเอนไซม์ที่สร้างผลิตภัณฑ์สี (IHC) หรือโดยฉลากเรืองแสงที่มองเห็นได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนส์ (immunofluorescence) — ซึ่งช่วยให้สามารถระบุชนิดของเซลล์และโมเลกุลที่การย้อมสีแบบปกติไม่สามารถแยกแยะได้

Definition

อิมมูโนฮิสโตเคมีและอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์เป็นวิธีการที่ใช้แอนติบอดีเพื่อระบุตำแหน่งของแอนติเจนจำเพาะในชิ้นเนื้อ โดยการจับแอนติบอดีที่ติดฉลากเข้ากับเป้าหมาย และตรวจจับฉลากที่จับอยู่ผ่านปฏิกิริยาสีของเอนไซม์ (อิมมูโนฮิสโตเคมี) หรือการเรืองแสง (อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์)

Scope

หัวข้อนี้ครอบคลุมหลักการของการติดฉลากด้วยแอนติบอดี การตรวจจับโดยตรงและโดยอ้อม ระบบการขยายสัญญาณ การดึงแอนติเจนกลับคืนมา (antigen retrieval) และการตรวจสอบความถูกต้องและการควบคุมคุณภาพของการทดสอบเหล่านี้ เป็นข้อมูลอ้างอิงทางระเบียบวิธีวิจัยและไม่ได้ให้การตีความทางคลินิกหรือคำแนะนำในการรักษา

Core questions

• แอนติบอดีสามารถระบุตำแหน่งโมเลกุลจำเพาะในเนื้อเยื่อได้อย่างไร?
• แผนการตรวจจับโดยตรงและโดยอ้อมแตกต่างกันอย่างไร?
• ระบบการขยายสัญญาณและการดึงแอนติเจนกลับคืนมาช่วยเพิ่มความไวได้อย่างไร?
• การทดสอบที่ใช้แอนติบอดีได้รับการตรวจสอบความถูกต้องและควบคุมอย่างไรเพื่อให้การตีความน่าเชื่อถือ?

Key concepts

• ความจำเพาะของการจับกันระหว่างแอนติเจน-แอนติบอดี
• การตรวจจับโดยตรงเทียบกับการตรวจจับโดยอ้อม
• การขยายสัญญาณ (เช่น ระบบอะวิดิน-ไบโอติน, โพลีเมอร์)
• ฉลากโครโมเจนิกเทียบกับฉลากเรืองแสง
• การดึงแอนติเจน (เอพิโทป) กลับคืนมา
• การควบคุมและการตรวจสอบความถูกต้องของการทดสอบ
• ความจำเพาะและการเกิดปฏิกิริยาข้าม

Mechanisms

เหตุการณ์หลักคือการจับกันอย่างจำเพาะเจาะจงของแอนติบอดีกับแอนติเจนภายในชิ้นเนื้อ ในวิธีโดยตรง แอนติบอดีปฐมภูมิ (primary antibody) จะมีฉลากติดอยู่เอง ในวิธีโดยอ้อม แอนติบอดีปฐมภูมิที่ไม่มีฉลากจะถูกตรวจจับโดยแอนติบอดีทุติยภูมิ (secondary antibody) ที่มีฉลาก ซึ่งทั้งขยายและทำให้การตรวจจับเป็นมาตรฐาน Coons และคณะเป็นกลุ่มแรกที่แสดงให้เห็นว่าแอนติบอดีที่ติดกลุ่มฟลูออเรสเซนต์สามารถระบุตำแหน่งของแอนติเจนในเนื้อเยื่อได้ (Coons, 1941) ซึ่งเป็นการก่อตั้งอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ การตรวจจับด้วยเอนไซม์ในเวลาต่อมาทำให้เกิดสัญญาณโครโมเจนิกถาวร และความไวเพิ่มขึ้นด้วยระบบการขยายสัญญาณ เช่น สารเชิงซ้อนอะวิดิน-ไบโอติน-เปอร์ออกซิเดส (avidin-biotin-peroxidase complex) (Hsu et al., 1981) และต่อมาคือการตรวจจับแบบโพลีเมอร์ เนื่องจากการตรึงด้วยอัลดีไฮด์สามารถบดบังเอพิโทป (epitopes) ผ่านการเชื่อมขวาง (cross-linking) ขั้นตอนการดึงแอนติเจนกลับคืนมาด้วยความร้อนหรือโปรตีเอสจึงมักถูกนำมาใช้เพื่อฟื้นฟูการจับของแอนติบอดีในเนื้อเยื่อที่ตรึงด้วยฟอร์มาลินและฝังในพาราฟิน (formalin-fixed paraffin-embedded tissue) (Shi et al., 1991) การตีความที่น่าเชื่อถือขึ้นอยู่กับการควบคุมเชิงบวกและเชิงลบที่เหมาะสม และการตรวจสอบความถูกต้องเชิงวิเคราะห์อย่างเป็นทางการของการทดสอบแต่ละครั้ง (Fitzgibbons et al., 2014)

Clinical relevance

การติดฉลากด้วยแอนติบอดีเป็นพื้นฐานของการวินิจฉัยและการวิจัยที่อาศัยเนื้อเยื่อสมัยใหม่ส่วนใหญ่ โดยการระบุสายเซลล์และเครื่องหมายโมเลกุลจำเพาะ ข้อมูลนี้อธิบายถึงวิธีการและข้อกำหนดด้านคุณภาพในเชิงแนวคิด เป็นแนวทางอ้างอิงและไม่ใช่พื้นฐานสำหรับการตัดสินใจวินิจฉัยหรือการรักษาเฉพาะบุคคล

Evidence & guidelines

คำแนะนำทางวิชาชีพเกี่ยวกับการตรวจสอบความถูกต้องเชิงวิเคราะห์ของการทดสอบอิมมูโนฮิสโตเคมีได้รับการเผยแพร่โดย College of American Pathologists (Fitzgibbons et al., 2014) และหลักการของวิธีการได้รับการรวบรวมไว้ในเอกสารอ้างอิงทางจุลพยาธิวิทยามาตรฐาน (Suvarna et al., 2018) วิธีการดึงแอนติเจนกลับคืนมาและการขยายสัญญาณมาจากงานวิจัยพื้นฐานเบื้องต้น (Shi et al., 1991; Hsu et al., 1981)

History

การระบุตำแหน่งด้วยแอนติบอดีเริ่มต้นด้วยวิธีแอนติบอดีเรืองแสงของ Coons และคณะในปี 1941 ซึ่งทำให้การตรวจจับโมเลกุลจำเพาะในเนื้อเยื่อเป็นไปได้ วิธีการติดฉลากด้วยเอนไซม์ในเวลาต่อมาให้สัญญาณที่มองเห็นได้ถาวร ระบบการขยายสัญญาณ เช่น สารเชิงซ้อนอะวิดิน-ไบโอติน-เปอร์ออกซิเดส (Hsu et al., 1981) เพิ่มความไว และการดึงแอนติเจนกลับคืนมาด้วยความร้อน (Shi et al., 1991) ขยายการย้อมสีภูมิคุ้มกันที่เชื่อถือได้ไปยังวัสดุที่ได้รับการตรึงและฝังในพาราฟินตามปกติ การกำหนดมาตรฐานและคำแนะนำในการตรวจสอบความถูกต้องตามมาเมื่อวิธีการเหล่านี้กลายเป็นหัวใจสำคัญของการปฏิบัติทางวินิจฉัย (Fitzgibbons et al., 2014)

Key figures

• Albert Coons
• Su-Ming Hsu
• Shan-Rong Shi

Seminal works

• coons-1941
• hsu-1981
• shi-1991

Frequently asked questions

ความแตกต่างระหว่างอิมมูโนฮิสโตเคมีและอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์คืออะไร?

ทั้งสองวิธีใช้แอนติบอดีเพื่อระบุตำแหน่งของแอนติเจนในเนื้อเยื่อ แต่อิมมูโนฮิสโตเคมีจะแสดงภาพแอนติบอดีที่จับอยู่ผ่านเอนไซม์ที่สร้างผลิตภัณฑ์สีที่มองเห็นได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์แสง ในขณะที่อิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ใช้ฉลากเรืองแสงที่มองเห็นได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนส์

เหตุใดจึงมักจำเป็นต้องมีการดึงแอนติเจนกลับคืนมา?

การตรึงด้วยฟอร์มาลินจะเชื่อมขวางโปรตีนและสามารถบดบังเอพิโทปที่แอนติบอดีรู้จักได้ ขั้นตอนการดึงแอนติเจนกลับคืนมาด้วยความร้อนหรือเอนไซม์สามารถเปิดเผยเอพิโทปเหล่านี้ได้ เพื่อให้การย้อมสีเป็นไปได้ในเนื้อเยื่อที่ตรึงด้วยฟอร์มาลินและฝังในพาราฟิน