Фиксация и окрашивание образцов

Фиксация и окрашивание — это два химических этапа, которые превращают цитологический образец в пригодный для интерпретации препарат. Фиксация стабилизирует клетки и сохраняет их внутреннюю структуру; окрашивание затем придает цвета и контраст, которые позволяют цитопатологу различать ядро от цитоплазмы и считывать детали хроматина. Выбор метода фиксации в сочетании с окрашиванием является преднамеренным и определяет, какие клеточные особенности будут выделены.

Definition

Фиксация и окрашивание образцов — это подготовительные этапы, которые сохраняют клеточную морфологию (фиксация) и придают избирательный цвет клеточным компонентам (окрашивание), чтобы цитологический препарат можно было исследовать под микроскопом.

Scope

Статья объясняет, почему и как фиксируются цитологические образцы (влажная фиксация против преднамеренного высушивания на воздухе), принципы основных цитологических окрашиваний и как комбинация фиксации-окрашивания подбирается к диагностическому вопросу. Это справочник по методам, не содержащий инструкций, специфичных для пациента.

Key concepts

• Коагулирующая спиртовая фиксация и влажная фиксация
• Преднамеренное высушивание на воздухе как подготовительное состояние
• Ядерное против цитоплазматического окрашивания
• Окрашивание по Папаниколау (прозрачное, полихроматическое)
• Окрашивание по Романовскому для высушенных на воздухе мазков
• Артефакт высыхания и его влияние на детали ядра
• Заключение под покровное стекло, просветление и долговечность препарата

Mechanisms

Фиксация останавливает аутолиз и закрепляет клеточные белки и нуклеиновые кислоты. В цитологии доминирующим фиксатором является этанол или спиртовой спрей, применяемый, пока мазок еще влажный (влажная фиксация), что сохраняет тонкий ядерный хроматин, необходимый для окрашивания по Папаниколау. В качестве альтернативы, мазку дают высохнуть на воздухе, что приводит к уплощению и увеличению клеток и является необходимой подготовкой для окрашивания по Романовскому. Окрашивание затем использует сродство заряженных красителей к клеточным компонентам: основные (катионные) красители связываются с кислым ядерным хроматином, в то время как кислые (анионные) красители окрашивают цитоплазматические белки. Окрашивание по Папаниколау сочетает ядерный гематоксилин с несколькими контрастирующими красителями для получения прозрачных, полихроматических клеток; окрашивание по Романовскому сочетает азуровые и эозиновые красители, взаимодействие которых дает характерный пурпурный хроматин и метахроматические цвета (Papanicolaou 1942; Wittekind 1982; Koss & Melamed 2006).

Clinical relevance

Поскольку фиксация и окрашивание определяют видимость тех самых признаков, которые используются для классификации клеток, они неразрывно связаны с цитологической диагностикой и составлением отчетов. Эта статья описывает методы и их обоснование в качестве основы для понимания лабораторной практики; она не является основой для индивидуальных клинических решений.

Evidence & guidelines

Методологическая литература устанавливает взаимодополняющие роли двух больших семейств красителей — окрашивания по Папаниколау с фиксацией спиртом для деталей ядра и хроматина и окрашивания по Романовскому для высушенных на воздухе мазков для цитоплазматических и фоновых признаков — а работа Виттекинда по стандартизации определила комбинацию азура B и эозина Y как эталонное окрашивание по Романовскому-Гимзе (Wittekind 1982; Bibbo & Wilbur 2014). Справочные тексты подчеркивают, что время и качество фиксации являются основными контролируемыми детерминантами результата окрашивания и артефактов, таких как вызванная высыханием ядерная дисторсия (Koss & Melamed 2006).

History

Цитологическое окрашивание развилось из гистохимии XIX века и гематологических красителей Романовского и Гимзы, затем было преобразовано для эксфолиативной цитологии полихроматическим, прозрачным красителем Папаниколау для влажно фиксированных мазков в 1940-х годах. Более поздние работы XX века, включая исследования Виттекинда по стандартизации красителей, стремились сделать окрашивание по Романовскому воспроизводимым в различных лабораториях (Papanicolaou 1942; Wittekind 1982).

Key figures

• George Papanicolaou
• Dietrich Wittekind

Seminal works

• papanicolaou-1942
• wittekind-1982
• koss-melamed-2006

Frequently asked questions

Почему некоторые цитологические мазки должны быть фиксированы, пока они еще влажные?

Влажная (спиртовая) фиксация сохраняет тонкие детали ядерного хроматина, от которых зависит окрашивание по Папаниколау. Если такой мазок высыхает до фиксации, артефакт высыхания искажает ядра и ухудшает интерпретацию.

Что определяет, какое окрашивание получит цитологический образец?

Это определяется состоянием фиксации и диагностическим вопросом: влажно фиксированные мазки окрашиваются по Папаниколау для изучения деталей ядра, тогда как преднамеренно высушенные на воздухе мазки окрашиваются по Романовскому, что выделяет цитоплазматические и фоновые признаки.