Молекулярные диагностические методы

Молекулярные диагностические методы выявляют паразитов путем амплификации и идентификации их нуклеиновых кислот, обеспечивая высокую аналитическую чувствительность и способность различать виды, генотипы и смешанные инфекции, которые могут быть пропущены при микроскопии и серологии. В паразитологии эти методы варьируются от обычной и ПЦР в реальном времени до изотермических форматов амплификации, разработанных для использования в местах оказания медицинской помощи в условиях ограниченных ресурсов.

Definition

Молекулярные диагностические методы в паразитологии — это лабораторные методы, которые обнаруживают и характеризуют паразитов путем амплификации и идентификации специфических для паразитов последовательностей нуклеиновых кислот, используя ПЦР и связанные с ней химические реакции амплификации для подтверждения инфекции, типирования видов и обнаружения инфекций низкой плотности или смешанных инфекций.

Scope

Тема охватывает обнаружение на основе нуклеиновых кислот в паразитологии: полимеразную цепную реакцию и ее варианты в реальном времени и гнездовую ПЦР, изотермические методы, такие как петлевая изотермическая амплификация (LAMP), и использование этих инструментов для типирования видов, обнаружения низкой плотности и выявления смешанных или скрытых инфекций. Она рассматривает молекулярное обнаружение как диагностическую методологию и не предоставляет протоколы клинического тестирования или лечения. Молекулярную диагностику в рамках бактериологии см. в соответствующем узле.

Core questions

• Как амплификация нуклеиновых кислот достигает чувствительности, превосходящей микроскопию и тесты на антигены?
• Когда типирование видов и генотипов изменяет диагностический или эпидемиологический вывод?
• Что делает изотермические методы, такие как LAMP, подходящими для использования в местах оказания медицинской помощи и в полевых условиях?
• Как следует интерпретировать обнаружение ДНК паразита относительно жизнеспособной, активной инфекции?

Key concepts

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
• Гнездовая и ПЦР в реальном времени (количественная)
• Петлевая изотермическая амплификация (LAMP)
• Типирование видов и генотипов
• Обнаружение смешанных инфекций и инфекций низкой плотности
• Аналитическая чувствительность и специфичность
• Обнаружение ДНК против жизнеспособности организма

Mechanisms

Эти методы используют последовательно-специфическое распознавание ДНК паразитов. В ПЦР термостабильная полимераза и праймеры, фланкирующие целевую последовательность, обеспечивают экспоненциальную амплификацию посредством повторяющихся циклов денатурации, отжига и элонгации, так что могут быть обнаружены даже очень небольшие количества исходных копий; гнездовая ПЦР добавляет вторую пару праймеров для повышения чувствительности и специфичности, а ПЦР в реальном времени количественно определяет амплификацию по мере ее протекания. Изотермические методы, такие как LAMP, достигают амплификации при одной температуре с использованием нескольких праймеров и полимеразы, вытесняющей цепь, что устраняет необходимость в термическом циклировании и позволяет использовать более простые, пригодные для полевых условий форматы. Поскольку амплификация нацелена на нуклеиновую кислоту, а не на жизнеспособный организм, положительный результат должен интерпретироваться с оговоркой, что остаточная ДНК может сохраняться после того, как паразит перестает быть живым.

Clinical relevance

Молекулярные методы улучшают обнаружение инфекций низкой плотности и смешанных инфекций, а также позволяют идентифицировать виды и генотипы, что направляет эпиднадзор и характеристику случаев. Эта статья описывает методы и их интерпретационные ограничения как доказательства и не является заменой лабораторных протоколов или клинических решений.

Epidemiology

Обнаруживая инфекции ниже микроскопического порога и разрешая смеси видов, молекулярные методы пересмотрели оценки субмикроскопического носительства паразитов при малярии и других инфекциях, информируя модели передачи и оценку программ контроля; изотермические форматы все чаще исследуются для децентрализованного тестирования в эндемичных регионах с ограниченными ресурсами.

History

Внедрение ПЦР с термостабильной полимеразой Сайки и его коллегами в 1988 году сделало рутинную амплификацию нуклеиновых кислот практичной и вскоре было адаптировано для паразитов, при этом анализы гнездовой ПЦР значительно повысили чувствительность обнаружения малярии к началу 1990-х годов. Описание петлевой изотермической амплификации в 2000 году открыло путь к малооборудованным, молекулярным диагностическим средствам для использования в местах оказания медицинской помощи, которые продолжают разрабатываться для паразитарных заболеваний.

Debates

Доказывает ли обнаружение ДНК паразита активную инфекцию?

Амплификация подтверждает присутствие нуклеиновой кислоты паразита, но сама по себе не может установить наличие жизнеспособного организма, поскольку остаточная ДНК может сохраняться после элиминации; это усложняет использование молекулярной позитивности в качестве теста на излечение.

Seminal works

• saiki-1988
• notomi-2000
• snounou-1993

Frequently asked questions

Почему молекулярные тесты часто более чувствительны, чем микроскопия?

Амплификация может умножить несколько копий ДНК паразита до обнаруживаемого сигнала, поэтому инфекции с очень низкой плотностью паразитов, которые микроскопия пропустила бы, все еще могут быть обнаружены и идентифицированы до вида.

Какое преимущество LAMP предлагает по сравнению с обычной ПЦР?

LAMP амплифицирует ДНК при одной постоянной температуре без термоциклера, что делает ее проще, быстрее и более подходящей для использования в местах оказания медицинской помощи и в полевых условиях, хотя разработка и интерпретация анализа все еще требуют осторожности.