Электронная микроскопия и ультраструктура

Электронная микроскопия использует пучок электронов, а не видимый свет, для получения изображений образцов, и поскольку электроны имеют гораздо более короткую длину волны, чем свет, она позволяет разрешать клеточные детали, значительно превышающие дифракционный предел оптического микроскопа. Это метод, который выявил клеточную ультраструктуру — тонкую архитектуру органелл и мембран — и остается эталонным методом для изучения мельчайших особенностей клетки.

Definition

Электронная микроскопия — это форма микроскопии, при которой электронный пучок, сфокусированный электромагнитными линзами, используется для формирования увеличенного изображения; применительно к клеткам она позволяет разрешать ультраструктуру — тонкую внутреннюю организацию мембран и органелл, находящуюся за пределами разрешения световой микроскопии.

Scope

Статья охватывает основы электронно-оптической визуализации, подготовку образцов (фиксация, заливка, нарезка, окрашивание тяжелыми металлами), необходимую для просмотра клеток, и ультраструктурные детали, которые выявляет метод. Она рассматривает электронную микроскопию как метод визуализации в клеточной биологии, а не как клиническое руководство.

Core questions

• Почему электронный пучок разрешает больше деталей, чем видимый свет?
• Как должны быть фиксированы, залиты и окрашены клетки для получения изображений?
• Какие ультраструктурные особенности становятся видимыми только с помощью электронной микроскопии?
• Какие артефакты подготовки могут искажать кажущуюся структуру?

Key concepts

• Визуализация электронным пучком
• Разрешение ниже дифракционного предела света
• Химическая фиксация
• Окрашивание тяжелыми металлами и электронная плотность
• Ультратонкое секционирование
• Режимы пропускания и сканирования
• Криоэлектронная микроскопия витрифицированных образцов
• Артефакты подготовки

Mechanisms

Поскольку разрешающая способность микроскопа улучшается по мере укорочения длины волны освещающего излучения, очень короткая длина волны ускоренных электронов позволяет электронному микроскопу разрешать ультраструктуру нанометрового масштаба. Клетки должны быть сделаны видимыми и стабильными в приборе: химическая фиксация сохраняет структуру, при этом альдегидная фиксация, введенная Сабатини и коллегами, обеспечивает хорошее сохранение как ультраструктуры, так и ферментативной активности, в то время как окрашивание тяжелыми металлами обеспечивает электронную плотность, которая создает контраст. Работа Паладе по фиксации и тонкой структуре митохондрий иллюстрирует, как тщательная подготовка сделала архитектуру органелл интерпретируемой. Криоэлектронная микроскопия, разработанная Дюбоше и коллегами, вместо этого витрифицирует образцы для их визуализации в почти нативном, гидратированном состоянии и позволяет избежать многих артефактов окрашивания и дегидратации.

Clinical relevance

Электронная микроскопия поддерживает диагностическую ультраструктурную патологию — например, при интерпретации биопсии почек и изучении ресничек и вирусов — и способствует исследованиям механизмов заболеваний. Эта статья описывает, как создаются и интерпретируются ультраструктурные изображения; она является справочно-образовательной и не служит основой для индивидуальных диагностических или лечебных решений.

History

Электронный микроскоп, разработанный в 1930-х годах, был применен к клетке в середине века и быстро преобразил клеточную биологию. Ранние исследования Паладе в начале 1950-х годов по фиксации и структуре митохондрий установили, как готовить и интерпретировать клеточные образцы, альдегидная фиксация (Сабатини, 1963) улучшила структурное и ферментативное сохранение, а введение криоэлектронной микроскопии (Дюбоше, 1988) позднее позволило получать изображения биологического материала в витрифицированном, почти нативном состоянии.

Debates

Насколько точно фиксированный, окрашенный, срезанный образец представляет живую клетку?

Традиционная подготовка включает фиксацию, дегидратацию, заливку и окрашивание тяжелыми металлами, каждый из которых может вносить артефакты; криометоды, которые витрифицируют гидратированные образцы, были разработаны отчасти для визуализации структуры, более близкой к ее нативному состоянию.

Key figures

• George Palade
• David Sabatini
• Jacques Dubochet

Seminal works

• palade-1952
• palade-1953
• sabatini-1963
• dubochet-1988

Frequently asked questions

Почему электронный микроскоп может видеть органеллы, которые не может видеть световой микроскоп?

Электроны имеют гораздо более короткую длину волны, чем видимый свет, и разрешение улучшается по мере уменьшения длины волны, поэтому электронный микроскоп разрешает ультраструктуру нанометрового масштаба, которая находится за пределами дифракционного предела света.

Почему клетки должны быть специально подготовлены для электронной микроскопии?

Образцы должны быть фиксированы, залиты, нарезаны на ультратонкие срезы и окрашены тяжелыми металлами для обеспечения стабильности и контраста в электронном пучке; альтернативно, криометоды витрифицируют образец для сохранения почти нативного, гидратированного состояния.