Электронная микроскопия и ультраструктура

Электронная микроскопия использует пучок электронов вместо света для визуализации тканей, достигая значительно более высокого разрешения и выявляя тонкие структуры — органеллы, мембраны и макромолекулярные организации — совокупно называемые ультраструктурой. Поскольку длина волны электронов значительно короче длины волны видимого света, этот метод позволяет различать детали значительно ниже предела разрешения светового микроскопа.

Definition

Электронная микроскопия — это метод микроскопии, который формирует изображения с использованием пучка электронов для достижения разрешения нанометрового масштаба; ультраструктура относится к тонким клеточным и тканевым деталям — органеллам и макромолекулярным компонентам — выявляемым при таком разрешении.

Scope

Эта тема охватывает причины высокого разрешения электронной микроскопии, специализированную подготовку образцов, которую она требует (тонкая фиксация, заливка в смолу, ультратонкое срезание, окрашивание тяжелыми металлами), а также различие между просвечивающим и сканирующим режимами. Это методологический справочник, который не предоставляет рекомендаций по клинической интерпретации.

Core questions

• Почему электронный пучок разрешает значительно более тонкие детали, чем видимый свет?
• Какая специализированная подготовка требуется для тканей при электронной микроскопии?
• Чем просвечивающая и сканирующая электронная микроскопия отличаются по тому, что они показывают?
• Как создается контраст в биологическом образце, который в противном случае имеет низкий контраст?

Key concepts

• Разрешение и длина волны электрона
• Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
• Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)
• Глутаральдегидная и осмиевая фиксация
• Заливка в смолу и ультратонкое срезание
• Окрашивание тяжелыми металлами (уранил, свинец)
• Ультраструктурная интерпретация

Mechanisms

Поскольку электроны имеют значительно более короткую длину волны, чем видимый свет, электронный пучок может разрешать структуры до нанометрового масштаба, что намного превосходит дифракционный предел световой микроскопии. Чтобы выдерживать вакуум и пучок, а также сохранять тонкую структуру, ткань фиксируется в жестких условиях — обычно альдегидная фиксация с последующей обработкой тетроксидом осмия, основываясь на химии альдегидной фиксации, описанной Сабатини и коллегами (Sabatini, 1963), — затем заливается в смолу и разрезается на ультратонкие срезы. Биологический материал слабо рассеивает электроны, поэтому контраст усиливается окрашиванием солями тяжелых металлов; цитрат свинца при высоком pH стал стандартным электронно-плотным красителем для этой цели (Reynolds, 1963). В просвечивающей электронной микроскопии электроны проходят через тонкий срез, формируя изображение внутренней структуры, тогда как в сканирующей электронной микроскопии пучок сканирует поверхность образца, а детектируемые сигналы формируют трехмерное изображение поверхности. Принципы и методы обобщены в стандартных справочниках (Bozzola & Russell, 1999; Hayat, 2000).

Clinical relevance

Ультраструктурное исследование способствует развитию клеточной биологии и используется в отдельных областях диагностической патологии, где тонкая структура является информативной. Данная статья концептуально объясняет методы; она описывает, как создаются ультраструктурные изображения, и не является основой для принятия индивидуальных диагностических или лечебных решений.

Evidence & guidelines

Подготовка образцов и получение изображений в электронной микроскопии обобщены в установленных методических справочниках (Bozzola & Russell, 1999; Hayat, 2000), основанных на фундаментальных первичных работах по альдегидной фиксации (Sabatini, 1963) и окрашиванию тяжелыми металлами (Reynolds, 1963).

History

Электронный микроскоп был разработан в 1930-х годах и применялся к биологическим тканям в середине XX века, как только методы подготовки смогли сохранять тонкую структуру. Альдегидная фиксация была охарактеризована для сохранения ультраструктуры (Sabatini, 1963), а стандартизированное окрашивание тяжелыми металлами, такое как цитрат свинца Рейнольдса (Reynolds, 1963), обеспечило контраст, необходимый для интерпретации клеточной ультраструктуры, сделав электронную микроскопию основой современной клеточной биологии.

Key figures

• David Sabatini
• Edward Reynolds

Seminal works

• sabatini-1963
• reynolds-1963

Frequently asked questions

Почему электронная микроскопия разрешает больше деталей, чем световая микроскопия?

Разрешение ограничено длиной волны используемого излучения; электроны имеют значительно более короткую длину волны, чем видимый свет, поэтому электронный пучок может различать структуры гораздо меньшего размера, чем световой микроскоп.

В чем разница между просвечивающей и сканирующей электронной микроскопией?

Просвечивающая электронная микроскопия пропускает электроны через ультратонкий срез для получения изображения внутренней структуры, в то время как сканирующая электронная микроскопия сканирует пучком поверхность образца и детектирует испускаемые сигналы для получения изображения топографии поверхности.